【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种靶向脑膜炎败血伊丽莎白菌的结合转移型的基因编辑系统及其应用。
技术介绍
1、病原菌耐药性正在威胁全球公共卫生安全和世界可持续发展目标，是人类当前面临的重大科学难题之一。新冠病毒合并耐药病原菌的双重感染，加大了整个临床医治的难度。伊丽莎白菌(elizabethkingia spp.)是人类临床的新兴病原菌，是院内侵入性感染的重要病原体。临床分离株主要是脑膜炎败血伊丽莎白菌(e.meningosepticum)和按蚊伊丽莎白菌(e.anophelis)，两种菌基因组同源性极高，临床表现一致，均可引起肺部感染和新生儿脑膜炎等疾病，且致死率较高，故临床上统称为伊丽莎白菌感染，其中，脑膜炎败血伊丽莎白菌的系列图谱如图1所示。近年来，伊丽莎白菌导致的感染病例呈上升趋势，在全球范围散发，加之该菌对β－内酰胺类、氨基糖苷类和四环素类等抗菌药物的高耐药率，将给临床治疗带来极大挑战。在我国伊丽莎白菌主要分布在icu和老年病房，临床分离率也在升高，且缺乏有效的监控措施，具有爆发流行的风险。因此对该新发病原菌的研究十分必要，尤其是挖掘针对其有效的抗感染药物靶点。
2、目前，关于伊丽莎白菌的研究主要集中在流行病调查统计阶段，对于其感染的分子机制还了解甚少。针对该新兴的病原菌分子机制的研究，尚缺乏有效的遗传操作系统，如何敲除致病性基因，消除耐药基因一直限制该病原菌的研究。因此，采用新型的结合型同源交换质粒系统无痕敲除系统以及dap营养缺陷型大肠杆菌x7213菌株直接靶向敲除多重耐药菌的耐药基因以及毒力基因，有利于
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于涉及提供一种靶向脑膜炎败血伊丽莎白菌的结合转移型的基因编辑系统及其应用。
2、本专利技术具体采用以下技术方案实现：
3、本专利技术第一方面提供了一种可水平转移的基因敲除载体pre112，该载体包含酶切位点smai和kpni。
4、(1)在原有载体的基础上于2980bp-3780bp处插入构建一段ermf序列。
5、顶部链：5’-atgacaaaaaagaaattgcc-3’
6、底部链：5’-ctacgaaggatgaaattttt-3’
7、(2)于2793bp-2979bp处插入构建一段启动子promoter_ermf序列：
8、顶部链：5’-tttaccactttccagtctta-3’
9、底部链：5’-tagtaacttcttacaggtga-3’
10、从而在同源重组载体导入脑膜炎败血伊丽莎白菌后，使得菌株获得红霉素抗性。
11、(3)在510bp-620bp处构建插入一段pompa序列：
12、顶部链：5’-gccacatttggtgttttttt-3’
13、底部链：5’-acttaatttttttaattaca-3’
14、本专利技术第二方面提供了一种含有敲除靶向耐药基因的可水平转移的基因敲除重组载体，该重组载体由敲除靶向耐药基因的同源重组连接片段与所述载体pre112重组构建得到。
15、进一步，所述敲除靶向耐药基因的同源重组连接片段通过以下步骤得到：
16、(1)选择靶向耐药基因；
17、(2)选取靶向耐药基因上下游各1000bp长度的序列，上游为up，下游为down；
18、(3)分别设计up、down的引物
19、up-forward：此引物为up片段的正向引物，同时在5’端带有与pre112载体的smai酶切位点顶部链的同源片段；
20、up-reverse：此引物为up片段的反向引物，同时在5’端带有与down片段底部链3’端的同源片段；
21、down-forward：此引物为down片段的正向引物，同时在5’端带有与up片段顶部链3’端的同源片段；
22、down-reverse：此引物为down片段的反向引物，同时在5’端带有与pre112载体的kpni酶切位点底部链的同源片段；
23、(4)以脑膜炎败血伊丽莎白菌为模板，进行pcr反应，扩增up、down基因片段；
24、反应体系：50μl
25、 2×prime star max 25μl 引物-forward 1μl 引物-reverse 1μl 脑膜炎败血伊丽莎白菌 1μl <![cdata[ddh<sub>2</sub>o]]> 22μl
26、(5)180v，20min对pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，对目的片段up和down所在条带进行切胶回收；
27、(6)以上述回收的up、down片段作为模板，up-forward、down-reverse为引物，进行融合pcr；
28、反应体系：50μl
29、 2×prime star max 25μl up-forward 1μl down-reverse 1μl up 1μl down 1μl <![cdata[ddh<sub>2</sub>o]]> 22μl
30、(7)180v，20min对pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，对up+down同源本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种可水平转移的基因敲除载体PRE112，其特征在于该载体包含酶切位点SmaI和KpnI，并且该重构载体在2980bp-3780bp处含有一段ErmF序列，在2793bp-2979bp处含有一段启动子Promoter_ErmF序列，在510bp-620bp处含有一段PompA序列。
2.一种含有敲除靶向耐药基因的可水平转移的基因敲除重组载体，其特征在于由敲除靶向耐药基因的同源重组连接片段与权利要求1所述载体PRE112重组构建得到。
3.如权利要求2所述的一种含有敲除靶向耐药基因的可水平转移的基因敲除重组载体，其特征在于所述敲除靶向耐药基因的同源重组连接片段通过以下步骤得到：
4.如权利要求2所述的一种含有敲除靶向耐药基因的可水平转移的基因敲除重组载体的构建方法，其特征在于所述载体PRE112的构建方法包括以下步骤：
5.利用权利要求2-4任一所述的重组载体敲除靶向耐药基因的方法，其特征在于包括以下步骤：
6.如权利要求1所述的可水平转移的基因敲除载体PRE112以及权利要求2所述的重组载体在敲除脑膜炎败血伊丽莎白菌
...【技术特征摘要】
1.一种可水平转移的基因敲除载体pre112，其特征在于该载体包含酶切位点smai和kpni，并且该重构载体在2980bp-3780bp处含有一段ermf序列，在2793bp-2979bp处含有一段启动子promoter_ermf序列，在510bp-620bp处含有一段pompa序列。
2.一种含有敲除靶向耐药基因的可水平转移的基因敲除重组载体，其特征在于由敲除靶向耐药基因的同源重组连接片段与权利要求1所述载体pre112重组构建得到。
3.如权利要求2所述的一种含有敲除靶向耐药...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐勇昌，张孟，马剑钢，杨晓强，付莹莹，覃秋莹，
申请(专利权)人：杭州师范大学，
类型：发明
国别省市：
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