【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及本专利技术涉及八种新烟碱类农药的群选性单克隆抗体的制备方法及其在酶联免疫分析方法中的应用，适用于包括吡虫啉、氯噻啉、噻虫胺、噻虫啉、烯式吡虫啉、啶虫脒、环氧虫啶、烯啶虫胺在内的八种新烟碱类农药的现场快速筛查，属于农药残留快速检测领域。
技术介绍
1、新烟碱类杀虫剂作为全球第一大杀虫剂，占杀虫剂市场的近四分之一，新烟碱类农药在全球范围内的大量使用导致其广泛存在于环境和生物链中，对生态系统和人类健康造成了极大的威胁。新烟碱类杀虫剂通过作用于昆虫的烟碱类乙酰胆碱受体而起到杀虫的作用，由于其分子量低，水溶性好，可被植物吸收且具有较长的持效期，增加了环境污染和非靶生物的暴露风险，易造成环境和中药材的污染。
2、不同国家或组织对新烟碱类农药残留进行了严格的限量或使用管理要求。早在2013年欧盟组织基于欧盟食品安全局的风险评估报告，对新烟碱类杀虫剂进行了相关的限制使用规定。作为欧洲农业大国，法国在2018年禁止了新烟碱类杀虫剂的使用。我国新烟碱类杀虫剂限量可能也会做出相应调整，甚至调整为不得检出，以适应形势的发展需求。目前我国针对10种常见的新烟碱类农药进行了应用品种登记，其中涵盖了多种蔬菜、水果、粮食作物和环境等多种样本。
3、鉴于新烟碱类农药残留的广泛危害性，为保障中药材的安全有效性，《中国药典》(2020年版，四部)提出了7种新烟碱类农药残留的多农药残留lc-ms/ms检测方法，但需要的仪器设备昂贵，并且操作复杂，对操作人员的要求较高，且限于专业实验室内使用。近年来，酶联免疫分析方法(elisa)因
4、我国生产的农药种类中有大量的混合制剂，且在现实的环境条件下，多农药残留是极为普遍的现象，农药混合物的快速检测是亟待解决的问题。目前虽然新烟碱类农药单克隆抗体及相关免疫分析方法已有报道，但均是针对单个化合物，有关广谱型新烟碱类杀虫剂抗体的制备及酶联免疫分析方法的研究尚未报道。针对上述问题，本专利技术提出了一种广谱型新烟碱类杀虫剂抗体的制备以及酶联免疫分析方法，从而实现多农药残留的快速检测。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于专利技术一种可用于八种新烟碱类农药(吡虫啉、氯噻啉、噻虫胺、噻虫啉、烯式吡虫啉、啶虫脒、环氧虫啶、烯啶虫胺)检测的广谱型单克隆抗体，并建立一种高灵敏度且简单的检测三嗪类农药的异源间接竞争elisa方法，该方法可用于环境及农产品中新烟碱类农药残留的快速同时检测。
2、本专利技术获得了能够产生特异性识别新烟碱类农药的广谱型单克隆抗体(mab)的小鼠杂交瘤细胞株，已于2022年11月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
3、本专利技术要求保护一种广谱型新烟碱类单克隆抗体，所述单克隆抗体为如下：
4、由保藏编号为45334的杂交瘤细胞株nnisg10产生的单克隆抗体。
5、技术方案：
6、本专利技术所述的广谱型新烟碱类杀虫剂单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
7、1.半抗原的合成
8、(1)在新烟碱类杀虫剂吡虫啉结构上引入合适的连接臂，合成吡虫啉免疫半抗原(imi-h)，合成路线如下：
9、
10、(2)在新烟碱类杀虫剂啶虫脒结构上引入合适的连接臂，合成啶虫脒免疫半抗原(ace-h)，合成路线如下：
11、
12、(3)在新烟碱类杀虫剂噻虫啉结构上引入合适的连接臂，合成噻虫啉免疫半抗原(thi-h)，合成路线如下：
13、
14、(4)在新烟碱类杀虫剂氯噻啉结构上引入合适的连接臂，合成氯噻啉免疫半抗原(imz-h)，合成路线如下：
15、
16、(5)在新烟碱类杀虫剂噻虫胺结构上引入合适的连接臂，合成噻虫胺免疫半抗原(clo-h)，合成路线如下：
17、
18、(6)在新烟碱类杀虫剂噻虫嗪结构上引入合适的连接臂，合成噻虫嗪免疫半抗原(tmx-h)，合成路线如下：
19、
20、2.人工抗原合成：
21、采用活泼酯法将所述的免疫半抗原和包被半抗原分别偶联到载体蛋白钥孔血蓝蛋白klh和牛血清蛋白bsa上，分别得到免疫原imi-klh、ace-klh、thi-klh、imz-klh、clo-klh、tmx-klh与包被原imi-bsa、ace-bsa、thi-bsa、imz-bsa、clo-bsa、tmx-bsa。
22、3.balb/c小鼠免疫
23、将制备好的免疫原等质量进行混合，得到混合免疫原，免疫balb/c雌鼠，每次每只小鼠腹腔及背部皮下给予100μg免疫原，两次免疫间隔时间为14天，共免疫四次，小鼠眼眶取血，用ic-elisa法检测血清效价及灵敏度。
24、4.细胞融合
25、通过血清效价及灵敏度测定，筛选出血清效价最高、灵敏度最好的小鼠，细胞融合前三天腹腔注射100μg免疫原进行冲刺免疫。取小鼠脾细胞，与对数生长期的sp2/0细胞通过peg法进行融合制备杂交瘤细胞，置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养一周，筛选出阳性杂交瘤细胞，将所述阳性杂交瘤细胞株注射同系小鼠腹腔诱生腹水，得到可以与8种新烟碱类农药小分子高亲和力结合的广谱型单克隆抗体。
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1.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为由保藏编号为45334的杂交瘤细胞株NNIsG10产生的单克隆抗体。
2.用于制备权利要求1所述的新烟碱类杀虫剂单克隆抗体的组合物，其特征在于，所述组合物由下述6种免疫原组成：IMI-KLH、ACE-KLH、THI-KLH、IMZ-KLH、CLO-KLH、TMX-KLH；其中所述IMI-KLH为巯基丙酸修饰的IMI-H与KLH的偶联物；所述ACE-KLH为巯基丙酸修饰的ACE-H与KLH的偶联物；所述THI-KLH为巯基丙酸修饰的THI-H与KLH的偶联物；所述IMZ-KLH为巯基丙酸修饰的IMZ-H与KLH的偶联物；所述CLO-KLH为巯基丙酸修饰的CLO-H与KLH的偶联物；所述TMX-KLH为巯基丙酸修饰的TMX-H与KLH的偶联物。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物中6种免疫原等质量混合。
4.根据权利要求3所述的免疫原等质量混合物在新烟碱类杀虫剂多残留检测免疫分析方法中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为由保藏编号为45334的杂交瘤细胞株nnisg10产生的单克隆抗体。
2.用于制备权利要求1所述的新烟碱类杀虫剂单克隆抗体的组合物，其特征在于，所述组合物由下述6种免疫原组成：imi-klh、ace-klh、thi-klh、imz-klh、clo-klh、tmx-klh；其中所述imi-klh为巯基丙酸修饰的imi-h与klh的偶联物；所述ace-klh为巯基丙酸修饰的ace-h与klh的...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨美华，骆骄阳，张竞，郭梦月，
申请(专利权)人：中国医学科学院药用植物研究所，
类型：发明
国别省市：
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