骨架蛋白源性多肽在制备抑制大肠癌细胞侵袭转移的药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种骨架蛋白源性多肽在制备抑制大肠癌细胞侵袭转移的药物中的应用。本发明专利技术的Ｖ＋Ｒｅｐｅａｔ融合性多肽对于大肠癌的侵袭转移的具有显著的抑制作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种骨架蛋白源性多肽在制备抑制大肠癌细胞侵袭转移的药物中的应用。
技术介绍
大肠癌等恶性肿瘤的侵袭和转移是一个多步骤的复杂过程，一般包括癌细胞的局 部增殖和扩展、分离和脱落、肿瘤组织新生血管形成、癌细胞进入循环、癌细胞降解脉管基 膜逸出循环及随后的定位生长等。然而，这一系列复杂步骤都离不开癌细胞自身的运动能 力。癌细胞的运动，包括细胞膜的伪足样伸展、膜流动性及细胞极性的变化等，是癌细胞侵 袭转移各步骤基本的共同的特征。癌细胞的运动的实现过程依赖皮层肌动蛋白的聚合和解 聚。Arp2/3复合物的激活介导此重要生化过程。Arp2/3的重要激活分子是以Cortactin和 N-WASP为代表的家族。两种蛋白的结构，尤其是和Arp2/3以及肌动蛋白单体结合的区域 (氨基酸序列)已经阐明。Cortactin的氨基端㈧以及随后的重复区域(R印eat)、N_WASP 的VCA区域，是激活Arp2/3必须的结构域。有研究表明，Cortactin和N-WASP与癌细胞的 侵袭转移有关，并在大肠癌组织中异常表达。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种骨架蛋白源性多肽在制备抑制大肠癌细胞侵袭转移 的药物中的应用。本专利技术的技术解决方案是一种骨架蛋白源性多肽在制备抑制大肠癌细胞侵袭转移的药物中的应用，其特征 是所述骨架蛋白源性多肽为如下氨基酸序列的V+R印eat融合多肽NKAALLDQIREGAQLKKVGRDALLDQIRQGIQLKSVSHGYGGKFGVEQDRMDKSAVGHEYQSKLSKHCSQVDSVRGFGGKFGVQMDRVDQSAVGFEYQGKTEKHASQKDYSSGFGGKYGVQADRVDKSAVGFDYQGKTEKHESQRDYSKGFGGKYGIDKDKVDKSAVGFEYQGKTEKHESQKDYVKGFGGKFGVQTDRQDKCALGWDHQEKLQLHESQKDYKTGFGGKFGVQSERQDSAAVGFDYKEKLAKHESQQDYSKGFGGKYGVQKDRMDKNASTF。本专利技术的V+R印eat融合性多肽对于大肠癌的侵袭转移具有显著的抑制作用。下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。具体实施例方式一种骨架蛋白源性多肽在制备抑制大肠癌细胞侵袭转移的药物中的应用，所述骨架蛋白源性多肽为如下氨基酸系列的V+R印eat融合多肽 NKAALLDQIREGAQLKKV GRDALLDQ IRQGIQLKSVSHGYGGKFGV FGGKFGVQMD KYGVQADRVD IDKDKVDKSA DRQDKCALGW DSAAVGFDYK ASTF。 实验证据1.多肽的设计和准备EQDRMDKSAV RVDQSAVGFE KSAVGFDYQG VGFEYQGKTE DHQEKLQLHE EKLAKHESQQGHEYQSKLSK HCSQVDSVRG YQGKTEKHAS QKDYSSGFGG KTEKHESQRD YSKGFGGKYG KHESQKDYVK GFGGKFGVQT SQKDYKTGFG GKFGVQSERQ DYSKGFGGKY GVQKDRMDKN人N-WASP由505个氨基酸组成，N-ffASP的V区域由第405至422及第433到 450 共 36 个氨基酸组成。氨基酸序列为 NKAALLDQIREGAQLKKV 和 GRDALLDQ IRQGIQLKSV。 除外V区域，N-WASP的羧基端包括CA区域，由451到505共55个氨基酸组成。氨基 酸序列为 ADGQESTPPT PAPTSGIVGA LMEVMQKRSKAIHSSDEDED EDDEEDFEDD DEWED。人 Cortactin由550个氨基酸组成，Cortactin的氨基端A区域由1-80个氨基酸组成， 单独该段区域仅与ARP2/3复合物结合但无促进肌动蛋白聚合的作用。其氨基酸序 列如下MWKASAGHAV SIAQDDAGAD DWETDPDFVNDVSEKEQRWG AKTVQGSGHQ EHINIHKLRE NVFQEHQTLKEKELETGPKA。人Cortactin的重复结构域(R印eat区域)由244个氨基酸组 成。其氨基酸序列如下SHGYGGKFGV EQDRMDKSAVGHEYQSKLSK HCSQVDSVRG FGGKFGVQMD RVDQSAVGFEYQGKTEKHAS QKDYSSGFGG KYGVQADRVD KSAVGFDYQGKTEKHESQRD YSKGFGGKYG IDKDKVDKSA VGFEYQGKTEKHESQKDYVK GFGGKFGVQT DRQDKCALGW DHQEKLQLHESQKDYKTGFG GKFGVQSERQ DSAAVGFDYK EKLAKHESQQDYSKGFGGKY GVQKDRMDKN ASTF。基于上述分子结构，产生5种多肽。按所在分子的功能区域命名，分别是 V(N-WASP)， CA(N-WASP)， A(Cortactin)， Repeat(Cortactin)， V+R印eat 融合多月太 (N-WASP&Cortactin)。V+R印eat 融合多Jj太是 V(N-WASP)与 R印eat (Cortactin)形成的融 合多肽，其氨基酸序列表示为NKAALL DQIREGAQLKKV GRDALLDQ IRQGIQLKSVSHGYGGKFGV EQDRMDKSAV GHEYQSKLSK HCSQVDSVRGFGGKFGVQMD RVDQSAVGFE YQGKTEKHAS QKDYSSGFGGKYGVQADRVD KSAVGFDYQG KTEKHESQRD YSKGFGGKYGIDKDKVDKSA VGFEYQGKTE KHESQKDYVK GFGGKFGVQTDRQDKCALGff DHQEKLQLHE SQKDYKTGFG GKFGVQSERQDSAAVGFDYK EKLAKHESQQ DYSKGFGGKY GVQKDRMDKNASTF。2.重组表达质粒的构建以及抑制性多肽的制备将与上述5种多肽对应的5种DNA片段通过分子克隆的方法插入真核表达质粒 PEGFP-N2,构建重组质粒 pEGFP-N2-V、pEGFP_N2_CA、pEGFP_N2_A、pEGFP_N2_R印eat 以及 pEGFP-N2-V-Repeat,并作鉴定。 将上述5种DNA片段通过分子克隆方法插入到原核表达质粒PGEX-4T-2，通过工程 菌生产多肽，HPLC纯化，低温保存备用。3.表达拮抗分子的大肠细胞系的建立以及癌细胞多肽导入的方法的建立将上述5种重组表达质粒通过脂质体转导大肠癌细胞LoVo，检测GFP表达情况，并采用G418筛选，获得稳定表达的细胞株。同时，将纯化的5种小多肽以Cy5荧光材料做标 记，随后采用Proteojuice 转导试剂将多肽导入大肠癌细胞HCT-8。4.细胞实验检测五种肌动蛋白装配拮抗分子对大肠癌细胞运动的影响采用细胞划痕分析法检测质粒转染和多肽导入的癌细胞的迁移能力的变化，采用 Capture-ELISA检测癌细胞内吞能力的变化；采用Boyden小室检测癌细胞侵袭能力的变 化；同时作细胞染色，观察癌细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种骨架蛋白源性多肽在制备抑制大肠癌细胞侵袭转移的药物中的应用，其特征是：所述骨架蛋白源性多肽为如下氨基酸序列的Ｖ＋Ｒｅｐｅａｔ融合多肽：ＮＫＡＡＬＬＤＱＩＲＥＧＡＱＬＫＫＶＧＲＤＡＬＬＤＱＩＲＱＧＩＱＬＫＳＶＳＨＧＹＧＧＫＦＧＶＥＱＤＲＭＤＫＳＡＶＧＨＥＹＱＳＫＬＳＫＨＣＳＱＶＤＳＶＲＧＦＧＧＫＦＧＶＱＭＤＲＶＤＱＳＡＶＧＦＥＹＱＧＫＴＥＫＨＡＳＱＫＤＹＳＳＧＦＧＧＫＹＧＶＱＡＤＲＶＤＫＳＡＶＧＦＤＹＱＧＫＴＥＫＨＥＳＱＲＤＹＳＫＧＦＧＧＫＹＧＩＤＫＤＫＶＤＫＳＡＶＧＦＥＹＱＧＫＴＥＫＨＥＳＱＫＤＹＶＫＧＦＧＧＫＦＧＶＱＴＤＲＱＤＫＣＡＬＧＷＤＨＱＥＫＬＱＬＨＥＳＱＫＤＹＫＴＧＦＧＧＫＦＧＶＱＳＥＲＱＤＳＡＡＶＧＦＤＹＫＥＫＬＡＫＨＥＳＱＱＤＹＳＫＧＦＧＧＫＹＧＶＱＫＤＲＭＤＫＮＡＳＴＦ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱建伟，马利林，
申请(专利权)人：南通大学附属医院，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]