【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于大动物骨骼染色，具体涉及一种用于大动物，尤其是巴马小型猪的新生猪或胎猪的骨骼染色的染色液及其使用方法。
技术介绍
1、近年来，猪作为非啮齿类大型实验动物，因其具有解剖学结构与人类相近的优势，逐渐被广大科学工作者认定为是研究人类疾病的致病病因、分子机制以及治疗方法的良好材料，尤其是模拟人类骨骼发育的理想模型，故此具有极高的培育价值。不同猪品系之间存在宏观和微观上的差异，大型成年猪由于高体重和处理困难在科学研究中可行性低。基于此，由于实验需要合适的动物模型，目前已经开发了几种小型猪品系用于研究。特别是在欧洲，哥廷根小型猪作为实验动物广泛分布。
2、巴马猪为我国特有的地方小型猪种，主要产自中国广西壮族自治区巴马瑶族自治县，2005年8月正式批准对“巴马小型猪”实施地理标志产品保护。在外观上巴马猪表现为典型的体型小及两头乌特征，即头部和臀尾部毛发为黑色，而其他部分为白色。小型猪被广泛接受为骨科模型，用于评估软骨和骨发育及缺损修复策略。与其他大型动物相比，猪的软骨层较厚，因此，除了骨软骨缺损外，还可以用来分析软骨发育形成机制。
3、目前，骨骼染色广泛用于小动物骨骼发育的研究，大动物的骨骼结构虽然与人类的骨骼结构更相似，但是大动物骨骼染色实验技术一直没有很好地解决，导致科学研究很大程度地受限。同时，相较于组织解剖与x线扫描法，骨骼染色法具有结果形象直观，能清晰的观察软骨及骨骼结构及其发育情况，实施过程成本低，无需复杂仪器设备。此外，骨骼染色法还具有其他研究方法所不具有的优势，能够更适合应用于大动物骨骼的
4、现有技术例如，公开号为cn103525119a、cn104596825a和cn10728764a的中国专利申请中报道的均是针对小动物骨骼进行染色的方法，经尝试后发现，用这些针对小动物骨骼进行染色的方法对大动物，如巴马小型猪的新生猪或胎猪进行染色时并不成功。
5、基于此，当前对适用于大动物，特别是巴马小型猪的新生猪或胎猪的骨骼染色方法存在需求。
技术实现思路
1、因此，本专利技术的一个目的是提供一种用于大动物骨骼染色的染色液。本专利技术的另一个目的是提供使用该染色液制备骨骼染色标本的方法。本专利技术提供的染色液和染色方法能够实现对大动物，尤其是巴马小型猪的新生猪或胎猪的骨骼及软骨的快速染色，达到清晰的观察巴马小型猪的新生猪或胎猪的骨骼及软骨的形态、发育情况和骨骼位置等预期实验的要求。
2、本专利技术的目的是基于以下技术方案实现的：
3、在本专利技术的上下文中，术语“大动物”是指相较于小鼠、大鼠及兔等出生及成年时体型较大的动物，例如巴马小型猪。
4、一方面，本专利技术提供了一种用于大动物骨骼染色的染色液，其包含软骨染色液和硬骨染色液；
5、其中所述软骨染色液由阿尔新蓝、乙酸和乙醇组成，在所述软骨染色液中，所述阿尔新蓝的含量为0.25～0.35％w/v，优选为0.3％w/v，所述乙酸和乙醇的体积比为1:3～5，优选为1:4；
6、所述硬骨染色液由茜素红和氢氧化钾的水溶液组成，在所述硬骨染色液中，所述茜素红的含量为0.1～0.2％v/v，优选为0.15％v/v，所述氢氧化钾水溶液的浓度为0.8～1.2％w/v，优选为1％w/v。
7、另一方面，本专利技术提供一种用于大动物骨骼染色的试剂盒，其包含本专利技术所述的染色液。
8、又一方面，本专利技术提供一种使用本专利技术所述的染色液进行大动物骨骼染色的方法，所述方法包括以下步骤：
9、1)将骨骼进行脱脂处理；
10、2)将步骤1)脱脂处理后的骨骼置于所述软骨染色液中，浸泡72～120小时；
11、3)使用体积分数为70～75％的乙醇水溶液处理步骤2)的骨骼以洗去浮色，然后将所述骨骼置于体积分数为95％的乙醇水溶液中12～48小时以稳定着色，再将所述骨骼置于1％w/v的koh水溶液中72小时；
12、4)将步骤3)的骨骼置于所述硬骨染色液中染色，染色时间不少于48小时，优选为48～96小时，得到染色的骨骼；和
13、任选地，5)将步骤4)得到的骨骼放置于保存液中。
14、优选地，在本专利技术所述的染色液进行大动物骨骼染色的方法中，所述大动物骨骼为巴马小型猪的新生猪或胎猪的骨骼。
15、优选地，在本专利技术所述的染色液进行大动物骨骼染色的方法中：
16、步骤1)的所述脱脂处理是通过包括以下步骤的方法进行的：将骨骼置于0～5℃，优选4℃的丙酮中浸泡48～96小时；
17、步骤2)的所述浸泡进行到肉眼看出软骨区域有蓝色着色；
18、步骤3)中所述洗去浮色是通过包括以下步骤的方法进行的：将步骤2)的骨骼置于体积分数为70～75％的乙醇水溶液中，每2～3小时换液一次，期间置于摇床轻轻摇动，共换液3～4次；
19、步骤4)的染色进行到肉眼可见骨质部分染为红色；
20、步骤5)的保存液包含等体积的甘油和无水乙醇。
21、再一方面，本专利技术提供一种使用本专利技术所述的染色液制备大动物骨骼染色标本的方法，所述方法包括以下步骤：
22、i.将动物个体去除皮肤、内脏组织和肌肉组织，然后用95％乙醇水溶液清洗去除皮肤、内脏组织和肌肉组织后的肢体，然后浸泡于4％w/v的多聚甲醛溶液中固定72～96小时；
23、ii.将步骤i固定后的动物样本进行脱脂处理；
24、iii.将步骤ii脱脂处理后的动物样本置于所述软骨染色液中，浸泡72～120小时；
25、iv.使用体积分数为70～75％的乙醇水溶液处理步骤iii的动物样本以洗去浮色，然后将所述动物样本置于体积分数为95％的乙醇水溶液中12～48小时以稳定着色，再将所述动物样本置于1％w/v的koh水溶液中72小时；
26、v.将步骤iv的动物样本置于所述硬骨染色液中染色，染色时间不少于48小时，优选为48～96小时；
27、vi.将步骤v的样本进行透明化处理，得到所述骨骼染色标本；
28、任选地，vii.将步骤vi.得到的骨骼染色标本放置于保存液中保存。
29、染色时确定体腔内或软骨关节区域无气泡，因大动物体型较大，应使用合适大小的容器，避免样本与容器壁紧密接触影响染色效果。为避免染色过度，可观察染色程度轻微调整染色时间。将标本放入保存液后仔细检查胸腔及腹腔有无气泡，保存容器不宜太小，以免标本不能很好的浸泡在标本保存液中。标本完全浸泡后封存阴凉处放置。
30、优选地，在本专利技术所述的使用本专利技术所述的染色液制备大动物骨骼染色标本的方法中：
31、在步骤i中，在去除皮肤、内脏组织和肌肉组织之前，将所述动物个体置于65～70℃的水中煮20～30秒，从而更加有利于浸泡、剥皮和剥离肌肉等组织；
32、在步骤ii中，在进行脱脂处理之前，将所述动物样本用双蒸水清洗6～8小时，每次2～3小时以去除固定液；本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于大动物骨骼染色的染色液，其包含软骨染色液和硬骨染色液；
2.一种用于大动物骨骼染色的试剂盒，其包含如权利要求1所述的染色液。
3.一种使用如权利要求1所述的染色液进行大动物骨骼染色的方法，所述方法包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述大动物骨骼为巴马小型猪的新生猪或胎猪的骨骼。
5.根据权利要求3所述的方法，其中：
6.一种使用如权利要求1所述的染色液制备大动物骨骼染色标本的方法，所述方法包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，其中：
【技术特征摘要】
1.一种用于大动物骨骼染色的染色液，其包含软骨染色液和硬骨染色液；
2.一种用于大动物骨骼染色的试剂盒，其包含如权利要求1所述的染色液。
3.一种使用如权利要求1所述的染色液进行大动物骨骼染色的方法，所述方法包括以下步骤：
4.根据权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵建国，孙泽文，闫星慧，王霄，张颖，秦国嵩，
申请(专利权)人：中国科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：
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