【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及一种产色氨酸的基因工程益生菌及其构建方法和应用。
技术介绍
1、色氨酸一种人体必需的氨基酸，仅可从各类食物的摄入中获得。trp及其代谢产物对一些关键生理功能有显著影响，包括免疫系统刺激和稳态、胃肠动力，甚至大脑活动。色氨酸在肠道微生物的代谢作用下，可以被转化为多种吲哚代谢产物，如吲哚乙酸、吲哚丙烯酸等，这些分子可促进肠上皮间的紧密连接，修复上皮屏障来维持肠道健康。但是当发生炎症性肠病时，肠道内的色氨酸水平下降，引起肠道免疫微环境异常，粘膜保护物质分泌减少，促炎因子生成增多等。已有文献报道在炎症性肠病患者及小鼠结肠组织中吲哚类物质含量明显降低，且与疾病活动度呈负相关。仅仅通过口服补充色氨酸，由于上消化道的吸收，到达结肠中的色氨酸水平不足以发挥治疗作用。
2、益生菌可以有效地长期定殖于结肠，并且还可以通过产生短链脂肪酸、改善肠粘膜屏障、减少促炎因子的产生等途径维护肠道健康。目前已有多种益生菌制剂应用于炎症性肠病治疗的临床试验阶段。大肠杆菌nissle 1917(escherichia coli nissle 1917，ecn)由于不表达毒力分子、具有良好的结肠黏附及定殖能力并且易于进行基因编辑等操作，已作为益生菌应用于炎症性肠病的治疗。
3、目前已有多种细菌经过基因工程化改造后，可以在体外大量合成色氨酸，如改造后的大肠杆菌w3110发酵罐中产量可达50g/l。然而其他种类的细菌由于其对人体而言，并非绝对安全的，且无相应的肠道保护作用。因此本专利技术拟在大肠杆菌nissle 19
技术实现思路
1、本专利技术的目的之一在于提供一种产色氨酸的基因工程益生菌，以至少解决上述问题之一，所述基因工程益生菌是将大肠杆菌nissle 1917的trpr基因敲除，并转入trpefbrd片段获得；
2、所述trpr基因cds的ncbi序列号为wp_000068679.1；
3、所述trpefbrd片段的序列如seq id no.12所示。
4、进一步的，敲除trpr基因是通过将seq id no.3所示的敲除片段trpr-kan转入大肠杆菌nissle 1917实现的。
5、本专利技术的目的之二在于提供所述基因工程益生菌的构建方法，包括以下步骤：
6、获得如seq id no.3所示的敲除片段trpr-kan；
7、将上述敲除片段电转入带有pkd46载体的大肠杆菌nissle 1917，筛选后获得trpr位点被替换为卡那霉素抗性片段的阳性转化子；
8、转化pcp20载体入上述阳性转化子，以消除抗性片段，构建出trpr敲除的大肠杆菌nissle 1917；
9、从大肠杆菌nissle 1917基因组中扩增trped基因片段；
10、使用bamh 1和xma l双酶切质粒pqe30，酶切产物与trped基因片段连接得到pqe30-trped载体；
11、将pqe30-trped载体中第878位碱基由t定点突变为c，解除色氨酸在合成中对trpe的反馈抑制，构建成功后转化入trpr敲除的大肠杆菌nissle 1917，得到色氨酸高合成的基因工程益生菌。
12、进一步的，敲除片段trpr-kan按照以下方法获得：以pkd4载体为模板，利用seq idno.1-2所示引物扩增所述敲除片段trpr-kan。
13、更进一步的，扩增trped基因片段所用引物序列如seq id no.8-9所示。
14、更进一步的，定点突变引物序列如seq id no.10-11所示。
15、本专利技术的目的之三在于提供所述基因工程益生菌在生产色氨酸中的应用。
16、本专利技术的目的之四在于提供一种生产色氨酸的方法，包括：诱导所述基因工程益生菌生产色氨酸。
17、进一步的，所述生产色氨酸的方法具体包括如下步骤：
18、一级种子培养：将所述基因工程益生菌接种至液体lb培养基中，36-38℃过夜培养，得一级种子培养液；
19、二级种子培养：取一级种子培养液接种于二级种子培养基，36-38℃培养10-12h，得二级种子培养液；
20、发酵培养：取二级种子培养液接种于发酵培养基，36-38℃培养40-45h。
21、更进一步的，所述二级种子培养基的组成为：葡萄糖20g/l，酵母粉15g/l，(nh4)2so4 4g/l，柠檬酸钠0.5g/l，mgso4 5g/l，kh2po4 1.5g/l，feso4 0.015g/l，ph 7.2；
22、所述发酵培养基组成为：葡萄糖20g/l，酵母粉1g/l，(nh4)2so4 4g/l，柠檬酸钠1g/l，mgso4 5g/l，kh2po4 2g/l，feso4 0.1g/l，ph 7.2。
23、本专利技术具有如下有益效果：
24、本专利技术的基因工程益生菌发酵生产色氨酸，培养40h产量可达35.87±0.22mg/l，是野生型大肠杆菌nissle 1917的276倍，具有发酵时间短、生产强度高的优点，与现有大肠杆菌改造菌株相比对人体安全性高，具有相应的肠道保护作用，可应用于炎症性肠病的治疗。
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1.一种产色氨酸的基因工程益生菌，其特征在于，是将大肠杆菌Nissle 1917的trpR基因敲除，并转入trpEFBRD片段获得；
2.根据权利要求1所述的产色氨酸的基因工程益生菌，其特征在于，敲除trpR基因是通过将SEQ ID NO.3所示的敲除片段trpR-KAN转入大肠杆菌Nissle1917实现的。
3.权利要求2所述基因工程益生菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，敲除片段trpR-KAN按照以下方法获得：以pKD4载体为模板，利用SEQ ID NO.1-2所示引物扩增所述敲除片段trpR-KAN。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，扩增trpED基因片段所用引物序列如SEQ ID NO.8-9所示。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，定点突变引物序列如SEQ ID NO.10-11所示。
7.权利要求2所述基因工程益生菌在生产色氨酸中的应用。
8.一种生产色氨酸的方法，其特征在于，包括：诱导如权利要求2所述基
9.根据权利要求8所述生产色氨酸的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
10.根据权利要求9所述生产色氨酸的方法，其特征在于，所述二级种子培养基的组成为：葡萄糖20g/L，酵母粉15g/L，(NH4)2SO4 4g/L，柠檬酸钠0.5g/L，MgSO4 5g/L，KH2PO41.5g/L，FeSO4 0.015g/L，pH 7.2；
...【技术特征摘要】
1.一种产色氨酸的基因工程益生菌，其特征在于，是将大肠杆菌nissle 1917的trpr基因敲除，并转入trpefbrd片段获得；
2.根据权利要求1所述的产色氨酸的基因工程益生菌，其特征在于，敲除trpr基因是通过将seq id no.3所示的敲除片段trpr-kan转入大肠杆菌nissle1917实现的。
3.权利要求2所述基因工程益生菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，敲除片段trpr-kan按照以下方法获得：以pkd4载体为模板，利用seq id no.1-2所示引物扩增所述敲除片段trpr-kan。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，扩增trped基因片段所用...
【专利技术属性】
技术研发人员：佘军军，李雯，刘亦晨，
申请(专利权)人：西安交通大学医学院第一附属医院，
类型：发明
国别省市：
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