【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物制药领域，并且特别涉及用于治疗和诊断的抗小鼠siglece胞外域的纳米抗体。
技术介绍
1、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素(siglece)是一类免疫球蛋白超家族的成员，siglecs受体家族是一种唾液酸识别受体，被认为是肿瘤唾液酸聚糖调节肿瘤浸润免疫细胞的主要靶点。siglecs在哺乳动物免疫系统中的各种细胞上广泛表达，siglecs家族通过与肿瘤细胞上的唾液酸聚糖结合，形成免疫抑制，使得肿瘤细胞逃脱免疫系统的监视，肿瘤发生发展。人源siglecs家族主要包括9个成员，在小鼠中的同源成员有5个。siglece，是一个一次跨膜的膜蛋白，膜外部分包括3个ig结构域，膜内具有一个itim基序。
2、siglece的结构包括胞外域(19-353位氨基酸残基，seq id no:16)，跨膜域(354-374，20个氨基酸残基)及胞内域(375-467，92个氨基酸残基)。胞外域包括一个可变v结构域(21-141位氨基酸残基，seq id no:17)和两个恒定结构域c1(152-239位氨基酸残基，seqid no:18)和c2(242-339位氨基酸残基，seq id no:19)。
3、肿瘤细胞表面的配体与siglece的结合使得肿瘤发生发展。干扰配体与siglece的相互作用可能可以提高抗肿瘤免疫能力。因此，对于siglece的研究可能逆转免疫抑制肿瘤微环境(tumor micro-environment,tme)，同时靶向siglece可能可以作为联合治疗癌症的潜在靶点。因此，需要研制
4、siglece的v可变域被认为是主要的配体结合域，因此靶向siglece的v可变域的小分子抑制剂可能具有临床价值，例如单域抗体。单域抗体，也称为纳米抗体(nbs)，是骆驼科(骆驼、美洲驼、羊驼)动物产生的小型抗体。该纳米抗体具有最小的可变抗原结合片段，被称为vhh结构域，其分子量约为15kda。与常规抗体相比，纳米抗体具有独特的优势：1)纳米抗体结构简单、分子量小，更有利于表达和使用；2)更方便在大肠杆菌和各种真核系统中高效大量表达；3)由于其只有一个结合位点，属于单域抗体，作为诊断试剂有更好的通透性、特异性和检测线性；4)便于与各种融合蛋白偶联或更容易被各种标记物标记；5)更易于制备双功能抗体，更有利于靶向药物开发和细胞靶点定向运输；6)作为药物开发，其对于人免疫原性小，不容易产生免疫排斥。
技术实现思路
1、本专利技术提供了能以高亲和力结合小鼠siglece胞外域的羊驼源抗体，该抗体又称为纳米抗体，其能够用于预防、治疗和/或诊断与siglece相关的病症，例如肿瘤。
2、本专利技术人使用重组的siglece胞外域对羊驼进行了4次免疫，然后分离出外周血淋巴细胞，并抽提细胞的总rna，随后反转录为cdna，将cdna用作模板以扩增纳米抗体序列。我们分离获得了4种纳米抗体，分别命名为ase1、ase4、ase12和ase17。这些纳米抗体的氨基酸序列分别如下：
3、ase1的氨基酸序列：
4、qvqlvesggglvqpggslrlscvvsgltfdhyamrwfrqapgkeregvscisisnsstyyaesvkgrftvsrdsakntvylqmnslkpedtavyhcatvdggrawcsplwarstydddywgqgtqvtvss(seq id no:12)
5、ase4的氨基酸序列：
6、qvqlvesggglvqaggslrlscaasgstfsanpigwyrqspgkqrelvavihsggdtnyipsmkgrftisrdnaknmvylqinnlkpedtavyycnafnslngrplsswgqgtqvtvss(seq id no:13)
7、ase12的氨基酸序列：
8、qlqlvesggglvqpggslrlsctvsgltfdyyamrwfrqapgkeregvscisvsnsstyyadsvkgrftisrddakntvylemnslkpedtavyycatvdggrgwcsplwarssydddywgqgtqvtvss(seq id no:14)
9、ase17的氨基酸序列：
10、qlqlvesggglvqpggslrlscavsgltfdqyamrwfrqapgkeregvscisvsnsstyysdsakgrftisrddakntvylemnslkpedtavyycatvdggrgwcsplwaranydddywgqgtqvtvss(seq id no:15)
11、这4种纳米抗体的三个抗原互补决定区(cdr1，cdr2和cdr3)如划线部分所示，具体如下：
12、ase1的抗原互补决定区：
13、cdr1:gltfdhyam(seq id no:1)
14、cdr2:gvscisisnss(seq id no:2)
15、cdr3:atvdggrawcsplwarstyd(seq id no:3)
16、ase4的抗原互补决定区：
17、cdr1:gstfsanpi(seq id no:4)
18、cdr2:lvavihsggd(seq id no:5)
19、cdr3:nafnslngrplss(seq id no:6)
20、ase12的抗原互补决定区：
21、cdr1:gltfdyyam(seq id no:7)
22、cdr2:gvscisvsnss(seq id no:8)
23、cdr3:atvdggrgwcsplwarssyd(seq id no:9)
24、ase17的抗原互补决定区：
25、cdr1:gltfdqyam(seq id no:10)
26、cdr2:gvscisvsnss(seq id no:8)
27、cdr3:atvdggrgwcsplwaranyd(seq id no:11)
28、具体地，本专利技术提供了一种纳米抗体或其抗原结合片段，该纳米抗体能够高亲和力结合siglece，并能阻断肿瘤细胞表面的配体与siglece的结合。该纳米抗体与fc融合后能够高亲和力结合siglece，能够在体外高效中和各种肿瘤细胞表面的配体，且能够在小鼠体内起到抗肿瘤的功效。四株纳米抗体结合在siglece的不同表位上，ase1、ase12和ase17结合在siglece的v可变域，而ase4结合在siglece的第一个恒定结构域。将ase1纳米抗体fc的融合蛋白的n端通过(ggggs)4接头蛋白与ase4的纳米抗体c端融合后形成一个双表位抗体(或称双特异性抗体)，该双表位抗体能够更高亲和力地结合siglece，能够更强的中和各种肿瘤细胞；腹腔注射该双表位本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.抗体或其抗原结合片段，其优选特异性结合SiglecE胞外域，优选所述抗体或其抗原结合片段源自羊驼，优选地，所述抗体为仅包括重链抗体的纳米抗体，其特征在于，所述抗体包含：
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包括选自如下组的序列：
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包括选自如下组中的一个或多个的序列：
4.根据权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段，其进一步包含Fc结构域，优选人Fc结构域和小鼠Fc结构域，其中人Fc氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，小鼠Fc氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。
5.双表位抗体，其(例如以N端到C端的顺序)包括两个根据权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段相互结合，所述纳米抗体或其抗原结合片段之间用接头序列(例如柔性多肽链，例如GS接头，优选(GGGGS)4接头)连接。
6.多核苷酸，其编码根据权利要求1-4中任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求5所述的双表位抗体。
7.
8.宿主细胞，其包含权利要求7所述的表达载体或权利要求6所述的多核苷酸，所述宿主细胞是用于表达外源蛋白的宿主细胞，例如细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
9.药物组合物，其含有权利要求1-4中任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求5所述的双表位抗体，以及药用载体。
10.权利要求1-4中任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段或权利要求5所述的双表位抗体在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途，优选地，所述肿瘤选自结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、前列腺癌、膀胱癌、肺癌、头颈癌、乳腺癌、食管癌、口腔癌、舌癌、牙龈癌、肝癌、骨癌、胃癌、睾丸癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、胰腺癌、结肠癌、肾癌、甲状腺癌和脑癌。
...【技术特征摘要】
1.抗体或其抗原结合片段，其优选特异性结合siglece胞外域，优选所述抗体或其抗原结合片段源自羊驼，优选地，所述抗体为仅包括重链抗体的纳米抗体，其特征在于，所述抗体包含：
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包括选自如下组的序列：
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包括选自如下组中的一个或多个的序列：
4.根据权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段，其进一步包含fc结构域，优选人fc结构域和小鼠fc结构域，其中人fc氨基酸序列如seq id no:21所示，小鼠fc氨基酸序列如seq id no:20所示。
5.双表位抗体，其(例如以n端到c端的顺序)包括两个根据权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体或其抗原结合片段相互结合，所述纳米抗体或其抗原结合片段之间用接头序列(例如柔性多肽链，例如gs接头，优选(ggggs)...
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