【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，涉及一种新型抗菌肽及其工程菌的构建方法和应用。
技术介绍
1、伊枯草菌素(iturin)主要是由芽孢杆菌合成的环脂肽类化合物，其结构为7个α-氨基酸残基组成的环肽骨架与含有14-17个碳原子的β-氨基脂肪酸侧链连接而成。研究表明iturin具有广谱的抗菌活性，尤其对病原丝状真菌具有较强的抑制作用。此外，它还具有高稳定性、低毒、低残留等特点，在生物防治、果蔬贮藏和生物医药等领域具有广阔的应用前景。然而其结构复杂，难以化学直接合成，且大多数野生型菌株iturin产量低(30-430mg·l-1)，无法满足工业化应用的需要。
2、启动子替换能够促进iturin、surfactin等环脂肽化合物的高效生物合成，然而，微生物代谢系统是由相互关联的代谢路径构成的复杂网络，这些基于启动子替换的静态调控策略，容易超载或破坏代谢网络失衡，导致有毒中间体的积累，底物转化率降低，产品得率降低。与静态调控相比，动态途径调控可平衡细胞生长和目的产物合成所需的物质流和能量流资源，可对目标产物进行精准调控，并可动态自主适应细胞内外环境的变化，如温度、渗透压和碳源的变化。
3、群体感应(quorum-sensing，qs)是随细胞培养密度变化而调控目标产物的动态调控系统，将细胞生长与基因表达耦合，以减少细胞“生长”和“生产”之间的细胞资源竞争，避免有毒代谢物的积累，动态调控目标化合物的生物合成。研究表明，apre和npre等胞外蛋白酶可降解comx，并可能影响comqxpa系统对群体感应系统启动子psrf的调
技术实现思路
1、本专利技术为构建高产iturin菌株，同时合成高抑菌活性，并具有新型结构的抗菌肽iturin，提供了一种新型抗菌肽的生产与应用技术。
2、为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、本专利技术的第一个目的是提供抗菌肽iturin，所述iturin化学结构式如式ⅰ所示：
4、
5、其中r为(ch2)nch3，所述n为7～14。
6、进一步的，前述的抗菌肽iturin，所述r为(ch2)7ch3，所述抗菌肽iturin命名为c10-iturin；
7、或者所述r代表(ch2)8ch3，所述抗菌肽iturin命名为c11-iturin；
8、或者所述r代表(ch2)9ch3，所述抗菌肽iturin命名为c12-iturin；
9、或者所述r代表(ch2)10ch3，所述抗菌肽iturin命名为c13-iturin。
10、本专利技术的第二个目的是提供单产前述的抗菌肽iturin的菌株，所述前述的抗菌肽iturin的菌株采用以下方法构建得到：
11、(1)以bacillus subtilis 1a751δpps为出发菌株，敲除surfactin基因簇中的srfab与srfac之间接口区域的基因片段，构建得到不产生环脂肽的底盘工程菌株b.subtilis 1a751 wr；
12、在某个特殊的实施例中，所述surfactin基因簇中的srfab与srfac之间接口区域的基因片段如sq id no.1所示；
13、(2)将iturin基因簇转入b.subtilis 1a751 wr，构建单产iturin菌株。
14、在某个特殊的实施例中，所述iturin基因簇登录号为：genbank oq410964。
15、进一步的，所述方法还包括步骤(3)：所述步骤(3)为将iturin基因簇的天然启动子pitu替换为p43、psrf或pm-srf其中之一和/或抑制所述单产iturin菌株的apre基因、npre基因中的至少一种。
16、本专利技术的第三个目的是提供一种构建前述菌株的方法，所述构建方法包括以下步骤：
17、(1)以bacillus subtilis 1a751δpps为出发菌株，敲除surfactin基因簇中的srfab与srfac之间接口区域的基因片段，构建得到不产生环脂肽的底盘工程菌株b.subtilis 1a751 wr；
18、在某个特殊的实施例中，所述surfactin基因簇中的srfab与srfac之间接口区域的基因片段如sq id no.1所示；
19、(2)将iturin基因簇转入b.subtilis 1a751 wr，构建单产iturin菌株。
20、在某个特殊的实施例中，所述iturin基因簇登录号为：genbank oq410964。
21、进一步的，所述方法还包括步骤(3)：所述步骤(3)为将iturin基因簇的天然启动子pitu替换为p43、psrf或pm-srf其中之一和/或抑制所述单产iturin菌株的apre基因、npre基因中的至少一种。
22、本专利技术的第四个目的是提供前述一种提高抗菌肽iturin产量的方法，所述方法为将前述菌株的iturin基因簇的天然启动子pitu替换为p43、psrf或pm-srf其中之一和/或抑制所述单产iturin菌株的apre基因、npre基因中的至少一种。
23、本专利技术的第五个目的是提供前述的抗菌肽iturin或前述的单产iturin菌株或前述的单产iturin菌株的发酵提取物在制备抑菌剂或抑菌药物中的应用。
24、进一步的，所述抑菌剂或抑菌药物能够抑制病原细菌和/或病原真菌。
25、进一步的，所述病原细菌包括clostridium perfringens、bacillus anthracis、staphylococcus aureus、micrococcus tetragenus、escherichia coli中的一种或多种的组合；所述病原真菌包括fusarium matsutum，botrytis cinerea，fusarium tricinctum和colletotrichum capsica中的一种或多种的组合。
26、进一步的，对病原细菌半数有效抑菌浓度(ic50)为40-60μg·ml-1；对病原真菌抑菌直径不高于25mm。
27、本专利技术技术方案相对于现有技术具有以下有益效果：
28、本专利技术提供抗菌肽iturin，以及产生所述的抗菌肽iturin的菌株。所述菌株能产生8种iturins，包括4种已知iturins和4种新型iturins，化学结构式如式ⅰ所示。所述抗菌肽iturin及该菌株发酵提取物本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.抗菌肽Iturin，其特征在于，所述Iturin化学结构式如式Ⅰ所示：
2.根据权利要求1所述的抗菌肽Iturin，其特征在于，所述R为(CH2)7CH3，所述抗菌肽Iturin命名为C10-iturin；
3.单产权利要求1所述的抗菌肽iturin的菌株，其特征在于，所述单产iturin菌株采用以下方法构建得到：
4.根据权利要求3所述菌株，其特征在于，所述方法还包括步骤(3)，所述步骤(3)为将iturin基因簇的天然启动子Pitu替换为P43、Psrf或PM-srf其中之一和/或抑制所述单产iturin菌株的AprE基因、NprE基因中的至少一种。
5.一种构建权利要求3所述菌株的方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(3)，所述步骤(3)为将iturin基因簇的天然启动子Pitu替换为P43、Psrf或PM-srf其中之一和/或抑制所述单产iturin菌株的AprE基因、NprE基因中的至少一种。
7.一种提高抗菌肽Iturin产量
8.权利要求1所述的抗菌肽Iturin或权利要求3或4所述菌株或权利要求3或4所述菌株的发酵提取物在制备抑菌剂或抑菌药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抑菌剂或抑菌药物能够抑制病原细菌和/或病原真菌。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述病原细菌包括Clostridiumperfringens、Bacillus anthracis、Staphylococcus aureus、Micrococcus tetragenus、Escherichia coli中的一种或多种的组合；所述病原真菌包括Fusarium matsutum，Botrytis cinerea，Fusariumtricinctum和Colletotrichum capsica中的一种或多种的组合。
11.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，对病原细菌半数有效抑菌浓度(IC50)为40-60μg·mL-1；对病原真菌抑菌直径不高于25mm。
...【技术特征摘要】
1.抗菌肽iturin，其特征在于，所述iturin化学结构式如式ⅰ所示：
2.根据权利要求1所述的抗菌肽iturin，其特征在于，所述r为(ch2)7ch3，所述抗菌肽iturin命名为c10-iturin；
3.单产权利要求1所述的抗菌肽iturin的菌株，其特征在于，所述单产iturin菌株采用以下方法构建得到：
4.根据权利要求3所述菌株，其特征在于，所述方法还包括步骤(3)，所述步骤(3)为将iturin基因簇的天然启动子pitu替换为p43、psrf或pm-srf其中之一和/或抑制所述单产iturin菌株的apre基因、npre基因中的至少一种。
5.一种构建权利要求3所述菌株的方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述方法还包括步骤(3)，所述步骤(3)为将iturin基因簇的天然启动子pitu替换为p43、psrf或pm-srf其中之一和/或抑制所述单产iturin菌株的apre基因、npre基因中的至少一种。
7.一种提高抗菌肽iturin产量的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求3所述菌株的itur...
【专利技术属性】
技术研发人员：辛志宏，吴国俊，王梦溪，殷晨悦，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：
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