【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物凝胶材料，特别涉及一种吸附沙门氏菌的长尾丝蛋白结合冷冻凝胶柱及其制备方法。
技术介绍
1、沙门氏菌是一种常见的典型食源性病原菌，属肠杆菌科，人畜共患病，革兰氏阴性肠道杆菌。广泛分布在河口、海水及沉积物、水产养殖等区域，寄生在海洋生物体中，通过污染的动物源性食品感染人类，危害人体健康。在水产中，沙门氏菌的浓度很低，在检测时存在一定问题。为了提高其检出限，需要进行高效浓缩。脂多糖(lps)是沙门氏菌等革兰氏阴性菌中的毒性物质，是其细胞外膜的特有结构，在细菌死亡或分解后被释放出来，本专利技术选取脂多糖作为一种特异性识别因子。脂多糖，由类脂a、内外核心多糖、o-抗原构成，其中o-抗原是一种特异性多糖。同时，脂多糖还可通过与细胞上的蛋白质或细胞膜上的受体，如内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞等作用，导致激活大量的次级炎症介质和细胞因子，如1l-1β、1l-6、1l-8和tnf-α等，这些炎症介质和细胞因子，可形成“瀑布效应”的恶性循环，在极微量的情况下便可使机体产生不良反应，诱导发生系统性反应综合症、多器官功能衰竭综合症、脓毒症等重要死亡疾病。同时脂多糖的结构很稳定，在160℃的温度下加热2～4个小时，或用强碱、强酸或强氧化剂加温煮沸30min以上，才能破坏其生物活性。
2、沙门氏菌具有复杂多样的抗原类型(分为2个种，7个亚种，2579个血清型)。本课题组以鼠伤寒沙门氏菌atcc14028为宿主菌分离纯化得到的噬菌体stp4-a，是目前genebank中有序列报道的90株沙门氏菌噬菌体中仅有9株宽谱噬菌体之一。裂解
3、有尾噬菌体通过尾丝蛋白实现对宿主菌的识别过程：长尾丝蛋白(ltf4-a)通过可逆的方式识别宿主表面初级位点，当长尾丝蛋白识别3个以上的位点后，短尾丝蛋白(stf4-a)通过不可逆的方式进一步和宿主菌表面的次级受体结合，实现最终的吸附。长尾丝蛋白(ltf4-a)由ltf-p37和ltf-p38构成，其中ltf-p37是一个由球状领口域、细长针状域和头部域构成的三聚体，是决定长尾丝蛋白亲和力的部分。由于长尾丝蛋白的作用是“首次筛选”，区分敏感细菌和非敏感细菌，因此它与细菌受体(例如脂多糖、鞭毛、菌毛等)的结合是可逆的。短尾丝蛋白与脂多糖的结合非常牢固，因为它们的作用是将噬菌体锚定在长尾丝蛋白选择的宿主上，它们确保了尾管穿透细胞外膜的过程中具有固定的结构。
4、目前现有的沙门氏菌吸附脱除方法包括：(1)磁分离法：使用磁分离技术，例如硼亲和磁珠等磁性吸附材料，其优点是可负载磁性，与样品分离非常方便，但其缺点在于对不同细菌菌种存在非特异性吸附。(2)琼脂糖凝胶吸附法：多以琼脂糖为基质，其优势在于可应用于抗原与抗体的偶联反应，但也存在由于凝胶孔径小导致细菌菌体容易造成柱堵塞的问题，同时对沙门氏菌的特异性较低。(3)离子交换层析法：离子交换层析法是根据样品和沙门氏菌等电点的不同，选用不同的阴离子交换柱和阳离子交换柱作为传质交换介质，使沙门氏菌分离以达到目标物纯化的目的。现有的沙门氏菌脱除方法有一定的局限性，有些方法的吸附效果也往往达不到理想的效果，反复使用导致柱压过高，凝胶柱堵塞，吸附率降低。
5、综上，建立一种新型液体样品沙门氏菌吸附柱是非常有必要的。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种吸附沙门氏菌的长尾丝蛋白结合冷冻凝胶柱，该材料可富集吸附液体样品中沙门氏菌，以及用于样品中沙门氏菌的脱除。
2、本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
3、一种长尾丝蛋白结合冷冻凝胶柱的制备方法，该方法包括如下步骤：
4、s1、丙烯酸羟丙酯/丙烯酰胺冷冻凝胶的合成：
5、原料组成：由丙烯酸羟丙酯(hpa)和丙烯酰胺(am)组成的聚合单体，n,n-亚甲基双丙烯酰胺(mbam)，烯丙基缩水甘油醚(age)，以及适量的活化剂四甲基乙二胺(temed)、引发剂过硫酸铵(aps)和超纯水；am和hpa的质量比为1:1～1.5。
6、合成方法：hpa、am、mbam和超纯水充分溶解，在冰浴搅拌条件下加入age并抽真空，加入促进剂temed和引发剂aps，转入封口的注射器中，在低温恒温槽-10℃至-14℃条件下聚合反应过夜，得到冷冻凝胶；
7、s2、冷冻凝胶的环氧活化，
8、冷冻凝胶用水清洗，用1～3mol/l的naoh溶液使凝胶充分置换为碱性环境；
9、将冷冻凝胶浸没在碱性的含有环氧氯丙烷的溶液体系中，震荡并滴加二甲基亚砜至完全混溶，摇床中进行环氧活化；
10、反应结束后，使用甘氨酸封闭羟基，再使用丙酮反复清洗，得到活化后的丙烯酸羟丙酯/丙烯酰胺冷冻凝胶；
11、s3、长尾丝蛋白的偶联：
12、将活化好的丙烯酸羟丙酯/丙烯酰胺冷冻凝胶与诱导表达获得的长尾丝蛋白ltf4-a进行偶联，偶联后的凝胶用水循环冲洗，最后置于pbs缓冲液、4℃保存。
13、本专利技术以丙烯酰胺(am)和n,n-亚甲基双丙烯酰胺(mbam)为第一主要单体的凝胶体系，为了结合更多的长尾丝蛋白，选择不同的第二主要单体来提高其环氧活化效果。
14、本专利技术将丙烯酰胺(am)和n,n-亚甲基双丙烯酰胺(mbam)的水溶液体系下引入丙烯酸羟丙酯(hpa)，在促进剂四甲基乙二胺(temed)和引发剂过硫酸铵(aps)的作用下，在低温条件下进行冷冻交联反应。然后，将上述形成的丙烯酸羟丙酯/丙烯酰胺冷冻凝胶使用环氧氯丙烷进行环氧活化，使其具备更多的环氧基团，有利于保证后续偶联反应的顺利进行。最后，本专利技术构建重组质粒pet-duet-gp3738-gp57a(质粒基因组cg图谱如图16所示，其核苷酸序列如seq id no：1所示)，通过诱导克隆表达获取鼠伤寒沙门氏菌atcc14028噬菌体stp4-a的长尾丝蛋白(ltf4-a)；将环氧活化后的冷冻凝胶偶联长尾丝蛋白，并验证其在样品中对鼠伤寒沙门氏菌atcc14028的吸附富集效果。
15、本专利技术所采用的冷冻凝胶与传统填充柱(例如镍亲和层析柱、琼脂糖凝胶柱)不同，冷冻凝胶是指在溶剂凝固点以下制备的3d大孔聚合物凝胶。其中，冰晶在形成凝胶的过程中发挥致孔的作用，解冻后形成凝胶产生相互连接、贯通的三维大孔结构。冷冻凝胶整体材料可以改善溶质的扩散，增加溶质分子同聚合物内部基团相互作用的机会。冷冻凝胶内的传递随流动发生，流动相和固定相之间可以快速传递。液体流动期间，冷冻凝胶的大孔径和平滑的流动通道也可以保证柱压处于较低状态，有效避免柱堵塞现象。由不同单体聚合而成的冷冻凝胶整体材料一般本身不具有吸附目标物质的能力，因此，需要在冷冻凝胶整体材料结构上接枝对目标物(鼠伤寒沙门氏菌atcc14028)具有特异性吸附能力的功能基团或功能活性物质。通常将含有功能基团的单体(长尾丝蛋白)加到冷冻凝胶的共聚物体系中，再通过配体与功能基团的化本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种长尾丝蛋白结合冷冻凝胶柱的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的长尾丝蛋白结合冷冻凝胶柱的制备方法，其特征在于：丙烯酸羟丙酯/丙烯酰胺冷冻凝胶的原料组成为：
3.根据权利要求1所述的长尾丝蛋白结合冷冻凝胶柱的制备方法，其特征在于：丙烯酸羟丙酯/丙烯酰胺冷冻凝胶的原料组成为：
4.根据权利要求1所述的长尾丝蛋白结合冷冻凝胶柱的制备方法，其特征在于：以原料体系中水的质量为100％计，丙烯酸羟丙酯(HPA)的质量分数为4.8～5.3％。
5.根据权利要求1所述的长尾丝蛋白结合冷冻凝胶柱的制备方法，其特征在于：S1、丙烯酸羟丙酯/丙烯酰胺冷冻凝胶的原料中，AM：HPA质量比为9：11。
6.根据权利要求1所述的长尾丝蛋白结合冷冻凝胶柱的制备方法，其特征在于：(AM+HPA)：MBAM和(AM+HPA)：AGE的摩尔比分别为8:1和6:1。
7.根据权利要求1所述的长尾丝蛋白结合冷冻凝胶柱的制备方法，其特征在于S2环氧活化的条件为：碱性的含有环氧氯丙烷的溶液体系中，2mol/L的Na
8.根据权利要求1所述的长尾丝蛋白结合冷冻凝胶柱的制备方法，其特征在于：S3偶联时，长尾丝蛋白溶液pH值控制在8.6～8.9。
9.一种权利要求1所述的方法制得的长尾丝蛋白结合冷冻凝胶柱。
10.一种权利要求9所述的长尾丝蛋白结合冷冻凝胶柱在吸附/脱除样品中沙门氏菌方面的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种长尾丝蛋白结合冷冻凝胶柱的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的长尾丝蛋白结合冷冻凝胶柱的制备方法，其特征在于：丙烯酸羟丙酯/丙烯酰胺冷冻凝胶的原料组成为：
3.根据权利要求1所述的长尾丝蛋白结合冷冻凝胶柱的制备方法，其特征在于：丙烯酸羟丙酯/丙烯酰胺冷冻凝胶的原料组成为：
4.根据权利要求1所述的长尾丝蛋白结合冷冻凝胶柱的制备方法，其特征在于：以原料体系中水的质量为100％计，丙烯酸羟丙酯(hpa)的质量分数为4.8～5.3％。
5.根据权利要求1所述的长尾丝蛋白结合冷冻凝胶柱的制备方法，其特征在于：s1、丙烯酸羟丙酯/丙烯酰胺冷冻凝胶的原料中，am：hpa质量比为9：11。
6....
【专利技术属性】
技术研发人员：王静雪，林洪，刘显君，刘培基，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。