【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医用材料，具体涉及一种卵巢组织低温冷冻保存液及其在卵巢组织冷冻保存中的应用。
技术介绍
1、恶性肿瘤放疗或化疗、需要放化疗或骨髓移植的血液系统疾病、卵巢相关疾病(双侧卵巢肿瘤、严重的子宫内膜异位症、卵巢扭转)、卵巢早衰风险(卵巢早衰家族史、先天性卵巢发育不全等)等均有极大可能损伤青春期及育龄期女性患者的生育功。随着相关良恶性疾病治疗手段的进步与发展，患者的生存期不断延长，女性患者在接受性腺毒性治疗之前的生育力保护问题已成为备受关注的研究领域。目前，女性生育力保存的方法主要包括药物性卵巢保护(应用促性腺激素释放激素类似物)、胚胎冷冻保存、卵巢刺激后卵母细胞冷冻保存、卵巢组织冷冻保存等。
2、目前美国生殖医学会认可的能够应用于临床的女性生育力保存方法有胚胎冷冻保存及卵巢刺激后卵母细胞冷冻保存两种策略。胚胎冷冻保存或卵巢刺激后卵母细胞冷冻保存得以实施的条件之一是需要对卵巢进行控制性超促排卵并穿刺取卵，胚胎冷冻保存还需要进行体外受精及胚胎培养。然而，对于放化疗无法延迟的女性以及青春期前、青春期少年，胚胎冷冻保存及卵巢刺激后卵母细胞冷冻保存均难以开展，卵巢组织的冷冻保存是这类人群生育力保存的主要策略。卵巢冻存后的移植可使女性恢复生育能力，产下后代。该策略已导致200多例活产
3、然而，卵巢组织在冷冻复温过程中会受到由冰晶造成的渗透性损伤和机械性损伤，冷冻保护剂造成的细胞毒性损伤，以及氧化应激损伤。近年来，在低温冷冻过程中活性氧对细胞的损伤引起了人们的关注。活性氧是一种高度活性分，可以氧化蛋白质，脂
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术有必要提供一种卵巢组织低温冷冻保存液，该冷冻保存液能够减轻卵巢组织冷冻保存过程中产生的氧化损伤，很好的保留卵巢组织生殖功能和内分泌功能。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种卵巢组织低温冷冻保存液，每100ml卵巢组织低温冷冻保存液由12～16％二甲基亚砜(v/v)、12～16％乙二醇(v/v)、0.5mol/l蔗糖、10～40mmol/l l-脯氨酸以及培养基余量组成。
4、本专利技术创新性的提出了一种卵巢组织低温冷冻保存液，具体的说，本专利技术以甲基亚砜、乙二醇作为渗透性低温保护剂，并在此基础上添加了l-脯氨酸、蔗糖作为非渗透性低温保护剂，特别是安全无毒且具有抗氧化特性的l-脯氨酸的添加。由于l-脯氨酸是一种天然氨基酸，其具有非常高的溶解度，中性ph值，且在高浓度、高渗透压下无毒，因此，本申请中采用l-脯氨酸作为渗透保护剂和抗氧化剂，其除了能够体外渗透保护，同时在冷冻、脱水和高温中增加蛋白质或膜的稳定性，且具有清除活性氧的能力，如羟基自由基、单线态氧和超氧阴离子。通过上述配方优化，本申请提出的卵巢低温冷冻保存液，能够有效减轻卵巢组织冷冻保存过程中产生的氧化损伤，改善移植后卵巢组织卵泡丢失。
5、其中，l-脯氨酸的浓度在10～40mmol/l能发挥显著效果，更优选的，l-脯氨酸的浓度在20mmol/l最佳。：
6、在本专利技术的一些典型的实施例中，卵巢组织低温冷冻保存液的组成为：每100ml卵巢组织低温冷冻保存液由15％二甲基亚砜(v/v)、15％乙二醇(v/v)、0.5mol/l蔗糖、20mmol/l l-脯氨酸以及培养基余量组成。
7、可以理解的是，其中采用的培养基没有特别的限定，可以为本领域中常规的培养基，在本专利技术一些典型的实施例中，所述培养基为dmem培养基。
8、本专利技术进一步提供了如前所述的卵巢组织低温冷冻保存液在卵巢组织冷冻保存中的应用。
9、本专利技术进一步提供了一种卵巢组织的冷冻保存方法，所述冷冻保存方法包括将卵巢组织冷冻保存于前述的卵巢组织低温冷冻保存液中的步骤。
10、本专利技术还提供了一种卵巢组织的冷冻保存方法，包括以下步骤：
11、将卵巢组织置于平衡液中放置5～10min；
12、随后将所述卵巢组织转移至前的卵巢组织低温冷冻保存液中放置5～10min后，将所述卵巢组织浸入液氮中并迅速转入冻存管中；
13、再将含有卵巢组织的冻存管置于-196℃进行保存。
14、其中，采用的平衡液组成可根据实际情况进行选择，本专利技术一些典型的实施例中，所述平衡液的组成为：每100ml平衡液由7.5％二甲基亚砜(v/v)、7.5％乙二醇(v/v)、0.5mol/l蔗糖和培养基余量组成。
15、进一步方案，所述冷冻保存方法还包括解冻过程，所述解冻过程包括以下步骤：
16、将含有卵巢组织的冻存管取出，37～40℃水浴条件下迅速将卵巢组织浸入复苏液中5～10min后，快速将卵巢组织转移至稀释液-1，37～40℃水浴条件下放置5～10min后，再依次转至稀释液-2和清洗液，各5～10min。
17、其中，复苏液、稀释液和清洗液的组成可根据实际情况进行选择，在本专利技术的一些典型的实施例中，所述复苏液的组成为：每100ml复苏液由0.5mol/l蔗糖和培养基余量组成；
18、所述稀释液-1的组成为：每100ml稀释液-1由0.25mol/l蔗糖和培养基余量组成；
19、所述稀释液-2的组成为：每100ml稀释液-2由培养基组成。
20、进一步方案，所述清洗液为pbs缓冲液。
21、本专利技术的有益效果：
22、本专利技术中的卵巢组织冷冻保存液，添加二甲基亚砜、乙二醇作为渗透性低温保护剂，并在此基础上添加了l-脯氨酸、蔗糖作为非渗透性低温保护剂，其中通过添加安全无毒且具有抗氧化特性的l-脯氨酸，减少卵巢组织冷冻过程中产生的活性氧与自由基，减轻氧化损伤，保护线粒体功能；同时还可以减轻卵巢移植过程中卵泡、胶原纤维的丢失，从而能够快速高效的冻存卵巢组织，有效提高移植后卵泡的存活率，降低卵泡凋亡。
23、并且本专利技术中的卵巢组织冷冻保存液除去了常规冻存保护液中的血清或血清替代物，从而有效避免了血清引起免疫排斥反应的可能性，安全性更高。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种卵巢组织低温冷冻保存液，其特征在于，每100mL卵巢组织低温冷冻保存液由12％～16％二甲基亚砜(v/v)、12％～16％乙二醇(v/v)、0.5mol/L蔗糖、10～40mmol/L L-脯氨酸以及培养基余量组成；
2.如权利要求1所述的卵巢组织低温冷冻保存液，其特征在于，所述L-脯氨酸的浓度为20mmol/L。
3.如权利要求1所述的卵巢组织低温冷冻保存液，其特征在于，所述培养基为DMEM培养基。
4.如权利要求1-3任一项所述的卵巢组织低温冷冻保存液在卵巢组织冷冻保存中的应用。
5.一种卵巢组织的冷冻保存方法，其特征在于，所述冷冻保存方法包括将卵巢组织冷冻保存于权利要求1-3中任一项所述的卵巢组织低温冷冻保存液中的步骤。
6.一种卵巢组织的冷冻保存方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.如权利要求6所述的卵巢组织的冷冻保存方法，其特征在于，所述平衡液的组成为：每100mL平衡液由5％-10％二甲基亚砜(v/v)、5％-10％乙二醇(v/v)、0.5mol/L蔗糖和培养基余量组成；
8.
9.如权利要求8所述的卵巢组织的冷冻保存方法，其特征在于，所述复苏液的组成为：每100mL复苏液由0.5mol/L蔗糖和培养基余量组成；
10.如权利要求8所述的卵巢组织的冷冻保存方法，其特征在于，所述清洗液为PBS缓冲液。
...【技术特征摘要】
1.一种卵巢组织低温冷冻保存液，其特征在于，每100ml卵巢组织低温冷冻保存液由12％～16％二甲基亚砜(v/v)、12％～16％乙二醇(v/v)、0.5mol/l蔗糖、10～40mmol/l l-脯氨酸以及培养基余量组成；
2.如权利要求1所述的卵巢组织低温冷冻保存液，其特征在于，所述l-脯氨酸的浓度为20mmol/l。
3.如权利要求1所述的卵巢组织低温冷冻保存液，其特征在于，所述培养基为dmem培养基。
4.如权利要求1-3任一项所述的卵巢组织低温冷冻保存液在卵巢组织冷冻保存中的应用。
5.一种卵巢组织的冷冻保存方法，其特征在于，所述冷冻保存方法包括将卵巢组织冷冻保存于权利要求1-3中任一项所述的卵巢组织低温冷冻保存...
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