一种农杆菌介导葡萄带根茎段快速遗传转化方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种农杆菌介导葡萄带根茎段快速遗传转化方法

【技术实现步骤摘要】
一种农杆菌介导葡萄带根茎段快速遗传转化方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种农杆菌介导葡萄带根茎段快速遗传转化方法
。

技术介绍

[0002]葡萄是一种营养价值高
、
极具经济价值的水果，随着生产的不断发展，人们对葡萄品种提出了更高的要求
。
葡萄作为多年生木本植物，有遗传背景复杂
、
生命周期长，基因组高度杂合的特点，致使常规杂交育种在葡萄品种改良上受到育种周期长
、
定向改良葡萄性状困难大等限制
。
[0003]为培育出更优质的葡萄新品种，基因工程的发展为其开辟出了一条新途径
。
据已有研究结果可知，葡萄最适合遗传转化的受体材料为原胚团，它不但具有很强的再生能力，且易于接受外源遗传物质
。
但原胚团诱导效率不稳定，且操作过程较为复杂，外植体采集也受时间限制，存在胚性难保持
、
生根困难
、
成苗耗时久等问题，因此，葡萄被认为是最难转化的植物之一r/>。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种农杆菌介导葡萄带根茎段遗传转化的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)
带根茎段的获取：以生长4～5周的葡萄幼嫩组培苗为材料，去除其上部茎秆及叶片，保留其根部及连接根部的茎段；
(2)
农杆菌活化：取已构建的导入目的基因的农杆菌，在
LB
固体培养基上划线培养1～2天，再挑取单菌落加入
LB
液体培养基中，振荡培养1～2天，吸取少量菌液加入
LB
液体培养基中，振荡培养至
OD
600
值介于
0.8
～
1.0
之间；
(3)
集菌重悬：将培养好的农杆菌菌液离心并弃去上清，用重悬液重悬，调整
OD
600
值介于
0.2
～
0.7
之间；
(4)
农杆菌侵染：将步骤
(1)
中的带根茎段置于步骤
(3)
重悬的农杆菌菌液中侵染，侵染结束后，将带根茎段置于共培养基中暗培养2～3天；
(5)
脱菌筛选：共培养结束后，带根茎段用脱菌液清洗，再用无菌水清洗，置于延迟筛选培养基中培养1周左右，之后更换至选择培养基中培育3～4周，筛选出具有抗性的成苗植株转置恢复培养培养基中继续培养；
(6)
成苗鉴定：待植株有4～5片新叶时便可进行
DNA
鉴定及
RNA
验证，利用
CTAB
法提取葡萄叶片
DNA
，对
pB7FWG2
载体所携带的
GFP
基因序列进行
PCR
扩增；提取叶片的
RNA
反转录成
cDNA
进行荧光定量检测，对其中
VvWRKY70
基因的表达量进行检测验证，最后筛选获得遗传转化植株
。2.
根据权利要求1所述的一种农杆菌介导葡萄带根茎段遗传转化的方法，其特征在于，步骤
(1)
中所述的葡萄品种为“霞多丽”。3.
根据权利要求1所述的一种农杆菌介导葡萄带根茎段遗传转化的方法，其特征在于，步骤
(2)
中所述的
LB
固体培养基和
LB
液体培养基中均含
10mg/L
利福平
、50mg/L
庆大霉素和
50mg/L
壮观霉素
。4.
根据权利要求1所述的一种农杆菌介导葡萄带根茎段遗传转化的方法，其特征在于，步骤
(3)
中所述的重悬液配方为：
1/2MS
培养基中添加
20g/L
蔗糖
、200
μ
mol/L
乙酰丁香酮，用
NaOH
调
...

【专利技术属性】
技术研发人员：仪慧兰，宋晶晶，李晋圆，李莉娟，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：