南瓜蛋白在制备治疗胃癌药物中的应用制造技术

南瓜蛋白在制药中的应用，能够从南瓜果肉中分离出一种核糖体失活蛋白——南瓜蛋白，该蛋白显示了良好的抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤药物。南瓜蛋白能显著抑制体外培养的胃癌细胞ＳＧＣ７９０１，肝癌细胞ＨｅｐＧ２、Ｂｅｌ７４０４，非小细胞肺癌细胞Ａ５４９，乳腺癌细胞ＭＣＦ－７及黑色素瘤细胞Ｂ１６，而对人正常肝细胞和外周血淋巴细胞的抑制作用较小，表现出明显的选择性；南瓜蛋白亦能在小鼠体内明显抑制宫颈癌Ｕ１４、黑色素瘤Ｂ１６和肺癌Ｌｅｗｉｓ等动物移植瘤。此外，本发明专利技术也证实了南瓜蛋白对肿瘤细胞的诱导凋亡和诱导分化作用是其抗肿瘤活性的重要机制。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗肿瘤药物领域，尤其涉及南瓜蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术介绍
恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的疾病，目前临床常用的化疗药物在杀伤肿瘤 细胞的同时，也很大地损伤了正常组织和细胞，这就限制了它的应用。寻找高效、低毒的治 疗肿瘤的药物已成为当前抗癌药物研究的方向和迫切任务。从天然物质中寻找抗肿瘤药物 已被认为是一种有效的途径，对天然活性物质进行抗肿瘤作用的研究，尤其在抑制增殖及 诱导凋亡和分化方面进行探索，将有助于获得理想的抗肿瘤药物。核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein, RIP)广泛存在于高等植物 中，迄今分离到的植物RIP约80余种。植物RIP通常按结构不同分为两型1型RIP为单链 蛋白，如天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)，在植物RIP中占多数；II型RIP是通过二硫键 连接的双链蛋白，如蓖麻毒素(ricin)。它们是一类RNA N-糖苷酶或多核苷酸腺苷糖苷 酶，具有抗生育、抗病毒和抗肿瘤等多种生物学活性。植物RIP抗肿瘤方面的研究早就引起 人们的兴趣RIP对肿瘤细胞的杀伤作用远比对正常细胞的强，尤其是与单克隆抗体交联 成的免疫毒素对肿瘤细胞具有靶向性和高杀伤效应。而有关RIP抗肿瘤的机制，最初认为 在于RIP的细胞毒作用所致的肿瘤细胞坏死，后来发现是通过诱导肿瘤细胞凋亡产生的。CN 1263107A提供了从南瓜中分离出的类型1RIP-南瓜蛋白(Cucurmosin)，并公 开了它的制备方法。SDS-PAGE显示它的分子量为27kDa，等电点pi > 9，具有强烈抑制细 胞内核糖体蛋白质合成的活性。南瓜蛋白已长出可供X-射线衍射用的单晶，晶体结构分 析结果指出，南瓜蛋白与天花粉蛋白具有结构同源性。CN 1603340A 提供了 南瓜蛋白具有RNAN糖苷酶活性和体外抑制白血病细胞增殖的抗肿瘤活性。本专利技术是基于上述现有技术基础，通过实验证实了南瓜蛋白对体外培养的实体瘤 细胞(胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌和黑色素瘤等)及小鼠移植瘤(黑色素瘤、宫颈癌和肺癌 等)具有显著的抑制作用，而对人正常肝细胞株L02及外周血淋巴细胞的影响小，表现出明 显的选择性。通过细胞形态观察、细胞增殖周期分析及琼脂糖凝胶电泳测定等研究发现，南 瓜蛋白对胃癌、肝癌和黑色素瘤等实体瘤细胞具有诱导凋亡的作用。此外，以黑色素瘤B16 细胞为模型，通过细胞形态观察、流式细胞仪分析及黑色素含量测定等研究发现，南瓜蛋白 对黑色素瘤细胞尚具有诱导分化的作用；对肿瘤细胞的诱导凋亡和诱导分化作用同时存 在，但低浓度时以诱导分化为主，而高浓度时则具有显著的诱导凋亡的作用。我们首次发现 南瓜蛋白能诱导肿瘤细胞分化，诱导分化是其抗肿瘤的新机制。南瓜蛋白对肿瘤细胞的诱 导凋亡和诱导分化作用是其抗肿瘤活性的重要机制。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过研究南瓜蛋白在体内外的抗肿瘤活性，提供南瓜蛋白在抗肿 瘤制药中的应用采用温和的分离纯化方法，包括盐溶液抽提、DEAE-纤维素过滤、CM-纤维素或 SP-琼脂糖等强或弱的阳离子凝胶介质二次离子交换层析分离，可以从南瓜果肉中分离到 南瓜蛋白，SDS-PAGE检测分子量为27kDa。层析纯的南瓜蛋白(纯度>97%)经过滤除菌 后用于实验。本专利技术提供了南瓜蛋白作为制备治疗肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、宫颈癌、黑色素瘤 药物的应用。具体实施例方式下面用具体的实施例来说明南瓜蛋白的药效作用和有益效果实施例1 南瓜蛋白对体外培养的肿瘤细胞的增殖抑制作用及对人正常细胞的影 响取对数生长期的肿瘤细胞(胃癌细胞SGC■，肝癌细胞IfepG2、Bel74(14，非小细胞肺 癌细胞A549，乳腺癌细胞MCF-7及黑色素瘤细胞B16)和人正常肝细胞L02接种于96孔培 养板上，每孔接种量分别为3000 4000个/100 ii L和6000个/100 u L ；无菌采集健康献 血者静脉血15mL，肝素抗凝，用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞，用含10%胎牛血 清的RPMI1640配制单个细胞悬夜，调细胞浓度为2X 105个/mL，接种于96孔培养板，每孔 100 PL。上述各培养板细胞培养24h后，实验组加不同浓度的南瓜蛋白lOOiiL，每个浓度 做三个复孔；阴性对照组加营养液100 yl，空白对照孔加营养液100 yL，用于仪器调零。作 用不同时间(48h和72h)后，每孔加5mg/mL的MTT20 u L，继续培养4h，甩去上清，每孔加 二甲亚砜150iiL。用酶标仪(BI0-RAD产品)测定570nm各孔的吸光度值(A57C1)，各组取平 均值，计算抑制率抑制率=(1-实验组A57Q/对照组A57Q)X100%。用SPSS12. 0进行统计 学分析，并计算IC5(I。结果南瓜蛋白对上述胃癌、肝癌、乳腺癌、非小细胞肺癌及黑色素瘤 细胞均具有明显的增殖抑制作用，并呈剂量依赖性和时间依赖性，其48h的IC5(I从9. 77到 36. 91 u g/mL, 72h的IC5(1从1. 94 u g/mL到13. 54 u g/mL ；而南瓜蛋白对人正常肝细胞和外 周血淋巴细胞抑制作用较小，其48h的IC50分别> 80 u g/mL和> 40 y g/mL, 72h的IC50分 别为27. 30ii40 y g/mL (表1)。可见南瓜蛋白对肿瘤细胞具有明显的选择性抑制 作用。表1南瓜蛋白对肿瘤细胞及正常细胞的半数抑制浓度4<table>table see original document page 5</column></row><table>实施例2 南瓜蛋白对SGC79Q1、IfepG2、Bel74(14、A549、MCF-7及B16细胞的诱导凋亡作 用(1)南瓜蛋白对上述肿瘤细胞形态的影响①荧光显微镜观察上述肿瘤细胞分别接种于多个盖玻片上，12h后加入不同浓 度的南瓜蛋白处理24、48和72h，用吖啶橙(AO)/溴乙啶(EB)混合荧光染料染色后，倒扣于 载玻片上，在荧光显微镜下观察细胞的形态学变。结果上述细胞均可观察到早、中期凋亡 细胞的细胞核或细胞质内有浓染致密的颗粒状黄绿色荧光，核染色质浓缩，核破裂，凋亡小 体释放等典型的凋亡细胞形态学改变；同时凋亡有时间及剂量依赖关系。②电子显微镜观察上述肿瘤细胞分别用20y g/mL南瓜蛋白作用48h为实验组， 同时以正常培养的上述细胞为对照组，各组细胞经0. 25%胰酶消化后，离心收集细胞沉淀， 用4°C预冷的2. 5%戊二醛-1%多聚甲醛混合液固定，锇酸后固定，环氧树脂包埋，超薄 切片，醋酸铀和柠檬铅染色，透射电子显微镜(HITACHI Hu-12A型)观察并拍照。结果上 述肿瘤细胞经南瓜蛋白作用后均出现典型的凋亡形态学改变，细胞变小，细胞质浓缩，内质 网扩张，核仁消失，细胞核内染色质边聚于核膜下，可见核固缩、核碎裂和凋亡小体；凋亡细 胞约占15-20% 0(2)流式细胞仪分析以2X105/mL接种于培养瓶中培养12h后，加入不同浓度南 瓜蛋白溶液继续培养24、48和72h，收集细胞，2000r/min离心5分钟，PBS洗1次后，倾去 本文档来自技高网...

【技术保护点】
南瓜蛋白作为制备治疗胃癌药物的应用。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈明晃，谢捷明，
申请(专利权)人：中国科学院福建物质结构研究所，福建医科大学，
类型：发明
国别省市：35[中国|福建]