基于聚合物微球变化的编码检测方法技术

本发明专利技术是基于聚合物微球变化的编码检测方法。采用表面偶联特异性的抗体、抗原、ＤＮＡ或ＲＮＡ片段的一系列不同粒径和内部结构的聚合物微球，通过免疫或基因杂交反应特异性识别待测样品中的抗原、抗体、ＤＮＡ或ＲＮＡ片段；用表面携带荧光物质的分子探针与待测抗体、抗原、ＤＮＡ或ＲＮＡ片段特异性偶联；在检测仪器中检测荧光信号，与阴性和阳性对照标本或已知浓度的标准品对比，判断待测样品是阴性或阳性；在检测仪器中对微球粒径和内部结构进行表征，根据微球粒径和内部结构与检测信息的一一对应关系，从而对待测物质进行准确判断。本发明专利技术是建立在免疫以及基因杂交特异性反应的基础上，对编码技术的创新，可同时实现多个待测样本或指标的检测，简单、快速、可靠。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医用检测
，主要涉及一种基于聚合物微球变化的编码检 测方法。本专利技术是建立在免疫反应以及基因杂交特异性反应的基础上，对编码技术的创新， 可同时实现多个待测样本或指标的检测，简单、快速、可靠。
技术介绍
在生物医学领域中，人们对生命现象的观察和研究已经深入到单细胞、单分子水 平。生物医学检测技术是现代生命科学与医学发展的重要手段和实验工具，尤其是对感染 性疾病、遗传性疾病和恶性肿瘤等的临床诊断具有极其重要的作用。流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是一种在功能水平上对细胞或其他生物粒子 定量检测和分选的分析方法，在生物床医学领域应用广泛。细胞或粒子在激光束的照射下 产生散射光和激发荧光，这两种光信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管 (PMT)接收。光散射信号在前向小角度进行检测，称为前向散射(forward scatter, FSC)， 这种信号反映了微球粒径或体积的大小；90°散射光又称侧向散射(side scatter, SSC)， 是指与激光束_液流平面垂直的散射光，其信号强度可反映微球内部复杂程度。检测后的 信号经计算机处理后即转化为可直观观察的一维直方图或二维散点图。流式细胞仪的分辨 率主要取决于仪器本身，常用变异系数(Cv)来表示，Cv = d/mX100% (d是分布的标准偏 差，m是分布的平均值)。近年来，流式细胞仪在技术原理和设计研制方面无突破性进展，但 在各种功能上却有了很大提高，尤其是荧光探针的不断推陈出新，使流式细胞仪新的参量 分析方面不断有新的发展，并使仪器不断向小型化，操作自动化、简单化方向发展。顾忠泽 等(CN1595149A)专利技术一种基于编码微球的微流控生物芯片，是基于流式细胞术原理发展 的一种新的检测技术。编码技术是目前用于医学检测以及科学研究的关键技术，是将待检测的信息转 换为微球颜色、粒径或者磁性等能快速、准确检测的信号，便于判断和筛选。Chandler等 (美国专利，US626822)利用聚苯乙烯纳米微球，溶胀吸附荧光物质实现了编码。颜晓梅等 (CN101392172A)制得了粒径均一的、羧基化荧光编码微球。苏星光等(CN101530766A)发 明了磁性荧光编码微球，集磁响应与荧光编码于一身，在应用方面具有很大优势。但是由于 荧光物质本身发光效率和稳定性难控制、不同波长荧光效率差别显著等引发的问题仍然存 在。目前应用较多微球聚合方法主要包括分散聚合、悬浮聚合、乳液聚合、种子聚合、SPG膜 乳化法等。20世纪八十年代Ugelstad等开发了种子溶胀聚合法，通过引入惰性溶剂和单体 一起溶胀单分散种子微球，可以用来制备单分散的聚合物微球。目前对种子溶胀聚合的理 论和方法已经相当成熟，通过二步种子溶胀聚合可以获得不同系列粒径、高度均勻的功能 化微球，不仅可以获得高交联度的致密微球，还能获得介孔或微孔球。由于微球表面带有功 能基团，特别是羧基基团，可以与抗体、抗原以及基因片段结合成为诊断微球。诊断微球基 于免疫反应或基因杂交特异性反应，特异地识别待测物质，通过流式细胞仪检测即可准确 判断样品中是否含有该物质或诊断患者是否患有某种疾病。目前很多液相生物芯片的载体微球采用荧光微球，由于微球荧光负载不均勻、稳定性差、容易发生泄漏、不同荧光波长的荧光效率不同，且荧光染料的成本较高、过程复杂， 在生物医学检测方面应用受限；对微球的要求高，不但要求微球高度均勻，表面官能团富集 而且能有效、稳定的包埋小分子。如何既能实现多通量同时检测、又能使操作简单、检测信 号稳定性强、区分度高，且成本低廉的编码技术，一直受到研究人员的广泛关注。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种易于检测、准确区分，同时实现多通量检测的基于聚合物微 球变化的编码检测方法，可广泛应用于生物学、临床医学、免疫学、药学等生物医学检测领 域。本专利技术提供了本专利技术采用表面偶联特异性的抗体、抗原、DNA或RNA片段的一系列不同粒径和内 部结构的聚合物微球，通过免疫反应或基因杂交反应特异性识别待测样品中的抗原、抗体、 DNA或RNA片段；用表面携带荧光物质的分子探针与待测的抗体、抗原、DNA或RNA片段特异 性偶联，使得微球表面呈现荧光颜色；在检测仪器中检测荧光信号，与阴性和阳性对照标本 或已知浓度的标准品对比，判断待测样品是阴性或是阳性；在检测仪器中对微球粒径和内 部结构进行表征，根据微球粒径和内部结构与检测信息的一一对应关系，从而对待测物质 进行准确判断。所述的聚合物微球是不同交联度的致密微球、介孔或微孔球；微球的粒径为2 30 μ m,相邻编码微球粒径间隔在1 10 μ m。所述的聚合物微球微球的粒径优选4 16 μ m。所述的聚合物微球为聚苯乙烯类微球、聚丙烯酸酯类微球、聚苯乙烯-丙烯酸共 聚微球或聚甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸共聚微球，分散系数低于15%。所述的微球表面带有氨基、羧基或氯甲基官能团，表面官能团负载率为0.5 1.5mm0l/g;与蛋白或基因结合成为诊断微球，从而建立不同微球与不同蛋白或基因的一一 对应关系。所述的抗体、抗原、DNA或RNA片段是抗结核杆菌抗体、抗乙肝病毒抗体抗微生物 抗体中的一种或几种；类风湿因子、抗甲状腺球蛋白抗体自身抗体中的一种或几种；抗小 鼠抗体、抗兔二抗第二抗体中的一种或几种；小鼠血清、兔血清动物血清抗原类中的一种或 几种；猪流感病毒NS1基因、胰岛素基因微生物体内的特异基因、人体或动物体内基因的转 录产物其中的一种或几种。所述的一一对应关系是表面偶联抗体的编码微球和荧光标记的同种抗体，对应检 测待测样品中的抗原；表面偶联抗原的编码微球和荧光标记的同种抗原，对应检测待测样 品中的抗体；表面偶联DNA片段或RNA片段的编码微球和荧光标记相同的DNA或RNA片段， 对应检测待测样品中的DNA或RNA片段。所述的检测仪器可分辨聚合物微球不同粒径和致密与介孔微球的散射光信号，优 选流式细胞仪。所述的检测仪器其检测信号的变异系数在20%以下；其前向角散射光信号最小 分辨尺寸为0. 3μπι ；其侧向角散射光信号反映微球密微球与介孔微球的散射信号强；将检测信号检转化为直观显示的一维直方图和二维散点图，以精确识别不同微球，通过一一对 应的关系确定待测物质的信息。所述的编码微球包括1)采用一系列粒径为 2um、4um、6um、8um、10um、12um、14um、16um、18um、 20 um,22u m、24 um,26u m、28 um,30um的致密微球，通过检测谱图能明显区分，可同时实 现16种不同待测物质的同时检测。2)采用一系列粒径为 2um、4um、6um、8um、10um、12um、14um、16um、18um、 20 um,22u m、24 um,26u m、28 um,30um的致孔微球，通过检测谱图能明显区分，可同时实 现16种不同待测物质的同时检测。3)采用 4 ii m、6 ii m、8 ii m、10 ii m、12 ii m、14 ii m、16 ii m粒径的微球，可编码 7 种诊断微球，分别采用致密、致孔两种不同内部结构的微球，可使得微球种类增加一倍；当采用不 同交联度微球时，能使得编码微球种类增加多倍，可实现本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于聚合物微球变化的编码检测方法，其特征在于采用表面偶联特异性抗体、抗原、ＤＮＡ或ＲＮＡ片段的一系列不同粒径和内部结构的聚合物微球，通过免疫反应或基因杂交反应特异性地识别待测样品中的抗原、抗体、ＤＮＡ或ＲＮＡ片段；用表面携带荧光物质的分子探针与待测的抗体、抗原、ＤＮＡ或ＲＮＡ片段特异性偶联，使得微球表面呈现荧光颜色；在检测仪器中检测荧光信号，与阴性和阳性对照标本或已知浓度的标准品对比，判断待测样品是阴性或是阳性；在检测仪器中对微球粒径和内部结构进行表征，根据微球粒径和内部结构与检测信息的一一对应关系，从而对待测物质进行准确判断。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：常津，李云红，张琦，宋涛，逯超亮，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]