多重定量核酸扩增及解链测定法制造技术

多重定量核酸扩增及解链测定法。本发明专利技术涉及应用被标记相同荧光报告标记但各自具有不同解链温度的复数个杂交探针，能够同时扩增、检测并定量复数种核酸靶的单管多重测定法。所述测定法可应用多组杂交探针进一步多重化，每组探针被标记独立的荧光报告标记。

【技术实现步骤摘要】
多重定量核酸扩增及解链测定法
本专利技术整体上涉及核酸的体外扩增、检测和定量。特别地，本专利技术涉及单管多重测定法(single-tubemultiplexassay)，其能够应用复数个被标记相同荧光报告标记的杂交探针，同时扩增、检测和定量复数个靶核酸。所述测定法可应用多种荧光报告基团来进一步复杂化(multiplexed)。
技术介绍
聚合酶链式反应(PCR)已经成为生物医学研究、疾病监测和诊断的一种普及的工具。美国专利4,683,195、4,683,202以及4,965,188中描述了通过PCR扩增核酸序列。PCR是现今本领域众所周知的技术，并广泛描述于科技文献中(参见PCRApplications，(1999)Innis等编辑，AcademicPress，SanDiego；PCRStrategies，(1995)Innis等编辑，AcademicPress，SanDiego；PCRProtocols，(1990)Innis等编辑，AcademicPress，SanDiego以及PCRTechnology，(1989)Erlich编辑，StocktonPress，Newyork)。“实时”PCR分析能够同时扩增和检测并且定量靶序列的起始量。应用DNA聚合酶的核酸酶活性的基础TaqMan实时PCR分析描述于Holland等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.88：7276-7280以及美国专利5,210,015。不需要核酸酶活性(无核酸酶分析)的实时PCR描述于2008年12月9日提交的美国申请系列号12/330,694。荧光探针在实时PCR的应用描述于美国专利5,538,848。典型的实时PCR方案(protocol)涉及使用特异于每个靶序列的标记探针。优选地，探针被标记一个或更多个荧光基团(moiety)，所述的荧光基团发射可检测波长的光。在杂交至靶序列或其扩增子后，探针显示出在荧光发射上的可检测变化。然而，在单管内分析多个靶的能力仍然是实时分析的主要挑战。几乎在医药以及诊断的每一个领域，被关注位点(loci)的数量迅速增长。例如，仅举几例，在法医DNA鉴定、病原微生物检测、多位点遗传疾病筛选以及多基因表达研究中必须分析多个位点。利用目前的方法，多重分析的能力受限于检测仪器。特别地，相同反应中应用复数个探针要求采用不同的荧光标记。为同时检测复数个探针，仪器必须能够区分每个探针所发射的光信号。目前的技术不允许在相同反应容器中超过四个单独波长的检测。例如，Bell等(“Real-timequantitativePCRinparasitology”，TrendsinParasitol.(2002)18(8)：337-342.)最近已调查了可用的实时定量PCR热循环仪，并报道都不能具有超过四个光学检测通道。因此，每个靶应用一个独特标记的探针，在同一反应容器中可检测不超过四个单独的靶。在实践中，至少一个靶通常是对照核酸。因此，在实践中，同一管内可检测不超过三个实验靶。由于光学硬件最多允许做很小的增量改进，多重分析的能力将跟不上临床需要，除非扩增以及检测策略进行根本变革。PCR后解链分析提供了额外的多重实时扩增反应能力(参见2006年6月23日提交的US2007-0072211)。在解链分析中，扩增的核酸通过其独特的解链曲线图(meltingprofile)来鉴定。解链分析涉及测定双链靶或者标记探针与靶的双链体的解链温度(解链点(meltingpoint))。如美国专利5,871,908所描述的那样，为测定应用了荧光标记探针的解链温度，靶核酸和探针的双链体在受控温度程序下逐步加热(或冷却)。双链体的解离改变了相互作用的复数个荧光团或荧光团与淬灭剂之间的距离。相互作用的荧光团可缀合至单独的探针分子，如美国专利6,174,670所述的那样。备选地，一个荧光团可缀合至探针，而其它的荧光团可嵌入核酸双链体，如美国专利5,871,908所述的那样。作为另外一个备选，荧光团可缀合至单个探针寡核苷酸。在双链体解链后，由于此时在单链探针中荧光团与淬灭剂靠拢，因此荧光团被淬灭。核酸双链体的解链通过测量荧光的相关变化而监测。荧光的变化可呈现在被称为“解链曲线”的图形上。由于不同的探针-靶双链体可被设计为在不同温度解链(或再退火)，每个探针将生成独特的解链曲线。恰当设计的探针将具有可与同一分析中其它探针可明确区别的解链温度。许多现有的软件工具可实现设计考虑了这些目标的用于同管多重分析的探针。例如，VisualOMPTM软件(DNASoftwatre，INC.，AnnArbor，Mich.)可实现确定不同反应条件下核酸双链体的解链温度。应用颜色检测和随后的扩增后解链分析的多重PCR方法描述于美国专利6,472,156。这样一种方法可检测的靶的数量，是可检测波长数量和可区别的解链曲线数量的乘积。因而在颜色检测中增加解链分析向检测复数个靶能力迈进了一步。扩增后解链分析最通常用于定量的目的，即鉴定靶核酸数量，参见美国专利6,174,670、6,427,156和5,871,908。已知可通过微分(differentiate)解链曲线函数获得解链峰。Ririe等(“ProductdifferentiationbyanalysisofDNAmeltingcurvesduringthepolymerasechainreaction”，(1997)Anal.Biochem.245：154-160)观察到微分可协助解析产物混合物生成的解链曲线。在微分之后，混合物中每个成分生成的解链峰变得容易区别。此前也已知扩增后解链信号，即解链峰与样品中核酸的量成比例。例如，美国专利6,245,514教导应用双链体嵌入染料的扩增后解链分析，以生成导数(derivative)解链峰，然后应用专有软件来整合峰。整合提供了有关扩增效率以及被扩增核酸相对量的信息。实践中，将期望其超越定性分析并能够定量相同样品中的复数个靶(参见例如Sparano等，“Developmentofthe21-geneassayanditsapplicationinclinicalpraticeandclinicaltrials”，J.Clin.Oncol.(2008)26(5)：721-728)。定量靶的量的能力在临床应用诸如测定病人血清中的病毒载量(viralload)、测量响应药物治疗的基因的表达水平、或测定肿瘤的分子标签(molecularsignature)以预测其对治疗的响应中是有用的。在实时PCR分析中，标记探针产生的信号与输入靶核酸的量成比例。输入得越多，荧光信号越早越过预设的阈值(Ct)。因而人们可以通过比较样品间或样品与具有已知量核酸的对照样品来确定靶核酸的相对或绝对量。然而，现有方法在同时定量复数个靶的能力上受到限制。对于复数个靶的定量检测，限制性因素是光学探测器。如上面所述，目前技术水平的光学技术不能在同一管中获得超过四个独立荧光标记探针的明显(distinct)信号。正在开发的技术承诺不超过六个独立探针的检测。因而需要从根本上不同的实验方法以容许在实时PCR期间扩增、检测并定量大量的核酸靶。专利技术概述本专利技术涉及在单个样品容器中扩增、检测以及定量一种本文档来自技高网...

【技术保护点】
在单个样品容器中扩增、检测并定量一种或更多种靶核酸的方法，其包括步骤：　　（ａ）使怀疑含有一种或更多种靶核酸的样品与至少一组寡核苷酸相接触，其中所述组内每个寡核苷酸被标记相同的一个或更多个报告基团，其中每个所述标记寡核苷酸　　ｉ．充分互补于至少一种靶核酸的至少一个子序列；　　ｉｉ．能够以不同于同组内其它标记寡核苷酸解链温度的解链温度与相应靶核酸结合；　　（ｂ）在包括温度变化区间的扩增反应中扩增样品中的靶核酸，其中所述标记寡核苷酸从与相应靶核酸的杂合子解离；　　（ｃ）检测在至少部分所述温度变化区间上来自所述报告基团的光发射；以及　　（ｄ）对步骤（ｃ）中在温度变化区间的至少所述部分上检测的光发射的一阶导数进行作图；　　（ｅ）确定步骤（ｄ）中作图的所述导数的最大值；　　（ｆ）重复步骤（ｂ）至（ｅ）复数次；以及　　（ｇ）将步骤（ｅ）确定的所述导数最大值相对于步骤（ｂ）至（ｅ）的重复数目进行作图，并确定步骤（ｅ）中确定的数值到达预设阈值时的重复数目，从而定量所述靶核酸的相对量。

【技术特征摘要】
US 2009-3-10 12/4009661.在单个样品容器中同时多重实时PCR扩增、检测并定量一种或更多种靶核酸的方法，其包括步骤：(a)使怀疑含有一种或更多种靶核酸的样品与至少一组寡核苷酸探针相接触，其中所述组内每个寡核苷酸探针被标记相同的一个或更多个报告基团，其中每个所述标记寡核苷酸探针i.充分互补于至少一种靶核酸的至少一个子序列；ii.能够以不同于同组内其它标记寡核苷酸探针解链温度的解链温度与相应靶核酸结合；(b)在包括温度变化区间的扩增反应循环中扩增样品中的靶核酸，其中所述标记寡核苷酸探针从与相应靶核酸的杂合子解离；(c)检测在至少部分所述温度变化区间上来自所述报告基团的光发射；以及(d)对步骤(c)中在温度变化区间的至少所述部分上检测的光发射的一阶导数进行作图；(e)确定步骤(d)中作图的所述导数的最大值；(f)重复步骤(b)至(e)复数次；以及(g)将步骤(e)确定的所述导数最大值相对于步骤(b)至(e)的循...

【专利技术属性】
技术研发人员：R希古奇，C霍尔康布，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]