三七病程相关蛋白1基因制造技术

本发明专利技术公开了一种三七病程相关蛋白1基因

【技术实现步骤摘要】
chain reaction
，
RT
‑
PCR)
扩增出
PnPR1
‑3的
ORF
，然后将其连接到
pGEM
‑
T
载体上，经测序获得具有目的基因的克隆；
[0013](2)
用限制性内切酶
SmaⅠ和
PstⅠ酶切
pGEM
‑
T
‑
PnPR1
‑3载体和植物表达载体
pCAMBIA2300s
，通过胶回收得到目的基因片段和载体大片段；再将所获得
PnPR1
‑3基因片段与
pCAMBIA2300s
载体片段连接，构建植物超表达载体；然后将所构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中表达；
[0014](3)
以重组载体
T
‑
DNA
上具有的抗性标记筛选转化子，并通过
PCR
以及
RT
‑
PCR
检测得到阳性转基因植株，分析转基因植株对病原真菌的抗性，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株
。
[0015]本专利技术中来自三七的
PnPR1
‑3基因能增强植物对棒弯孢的抗性，将该基因导入烟草中，可以获得具有真菌抗性的新品种和新材料
。
本专利技术为提高植物对真菌病害的抗性提供了一种新的方法，通过基因工程手段培育抗病植物可以克服传统育种的不足，这不仅缩短了育种周期，而且操作简单，容易获得高抗材料
。
利用基因工程技术培育抗性植物品种和材料具有明显的优势和不可取代的重要性；它不仅可以为大规模生产作物
、
花卉
、
药材等提供方便，还可以帮助减少化学农药的使用，为农业生产节约成本
、
减少环境污染
。
因此本专利技术具有广阔的市场应用前景
。
附图说明
[0016]图1是本专利技术中部分
PnPR1
‑3转基因烟草基因组
DNA
的
PCR
检测结果，其中
Marker
：
DL2501 DNA Marker(
上海捷瑞
)
，由
2,000bp、1,000bp、750bp、500bp
以及
250bp
五条
DNA
片段组成；阳性对照：质粒
pGEM
‑
T
‑
PnPR1
‑3为模板的
PCR
反应；
WT
：非转基因烟草
(
野生型
)
总
DNA
为模板进行的
PCR
；
[0017]图2是本专利技术中部分阳性
PnPR1
‑3转基因烟草中
PnPR1
‑3转录水平的表达分析结果图，其中
Marker
：
DL2501 DNA Marker(
上海捷瑞
)
；
WT
：非转基因烟草总
RNA
逆转录
cDNA
为模板的
PCR
产物；阳性对照：质粒
pGEM
‑
T
‑
PnPR1
‑3为模板的
PCR
产物；
[0018]图3是本专利技术中
PnPR1
‑3转基因烟草抗病性鉴定的结果图；图中是接种棒弯孢的
PnPR1
‑3转基因烟草叶片；其中
WT
为野生型烟草叶片，3‑
1、3
‑
3、3
‑
6、3
‑
13
为
PnPR1
‑3转基因烟草株系的叶片
。
具体实施方式
[0019]下面通过附图和实施例对本专利技术进一步说明，但本专利技术保护范围不局限于所述内容，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂
。
[0020]实施例1：
PnPR1
‑3全长
cDNA
克隆以及序列分析
[0021]用棒弯孢接种三七根部，用接种后
24h
的三七根部提取总
RNA
，用液氮将接种后的三七根研磨成粉末，转入离心管中，按照
Super
总
RNA
提取试剂盒操作说明提取总
RNA。
采用
Go ScriptTM Reverse Transcriptase System
以总
RNA
为模板合成
cDNA
第一链，反应体系和操作过程为：取5μ
g total RNA
，依次加入1μ
L Oligo dT15 primer、1
μ
L Random primer
，用
Nuclease
‑
Free Water
将反应体积补齐至
10
μ
L
；混匀，
70℃
加热变性
5min
后迅速
在冰上冷却
5min
，然后依次加入4μ
L 5
×
Reaction Buffer、4
μ
L MgCl2(25mM)、1
μ
L PCR Nucleotide Mix、0.4
μ
L Recombinant Ribonuclease Inhibitor、0.4
μ
L Reverse Transcriptase、1.2
μ
LNuclease
‑
Free Water
，混匀并简短离心，
25℃
静置
5min
，
42℃
温浴
1.5h
，取出后
70℃
加热
10min
，终止反应；
cDNA
第一链合成后置于
‑
20℃
保存备用
。
[0022]以合成的第一链
cDNA
为模板，扩增目的基因
PnPR1
‑3，所用上下游引物序列分别为5’
ATGGCTTCCTTTCACCAAGTAAAA3
’
及5’
CTCAATAAGGATGGTCGCCTACG3
’
。PCR
反应条件：
95℃5min
；
94℃30s
，
59℃30s
，
72℃1min
，...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种三七病程相关蛋白1基因
PnPR1
‑3，其核苷酸序列如
SEQ ID NO:1
所示
。2.
权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘迪秋，孙皓，甘昆发，车晓莉，顾悦，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：