用于可视化检测毕赤酵母残留制造技术

本发明专利技术提供了一种用于可视化检测毕赤酵母残留

【技术实现步骤摘要】
用于可视化检测毕赤酵母残留DNA的pfAgo检测试剂盒及其用途


[0001]本专利技术属于生物与化学领域，具体涉及一种用于可视化检测毕赤酵母残留
DNA
的
pfAgo
检测试剂盒及其用途
。

技术介绍

[0002]Argonaute
蛋白是一类广泛存在于自然界生物体内的蛋白质家族，根据来源可分为真核
Argonaute
蛋白质
(eukaryotic Argonaute proteins,eAgos)
和原核
Argonaute
蛋白质
(prokaryotic Argonaute proteins,pAgos)。PfAgo
是源自糠秕焦球菌
(Pyrococcus furiosus)
的原核
Argonaute(pAgo)
，是一种由
DNA
介导的核酸内切酶
。
其反应温度大概在
87℃
‑
99.9℃。
在高温反应条件下，提供成对的
gDNA
可以介导
PfAgo
切割双链
DNA
产生特定的末端，发挥类似限制性内切酶的功能
。gDNA
内突变位点的位置会显著影响靶切割效率，使
PfAgo
的切割具有高度特异性
。
[0003]蛋白药物是利用生物工程技术改造人体内天然存在的蛋白质结构制造的一类具有治疗作用的药物，包括重组蛋白
、
疫苗以及特殊的单克隆抗体
。
蛋白药物是现代生物制药领域的重要组成部分，目前被广泛应用于治疗癌症
、
糖尿病
、
心血管疾病等疾病
。
为了高效地表达和纯化目标蛋白质，制备蛋白药物时常需使用不同的表达系统，毕赤酵母是目前应用比较广泛的蛋白药物表达体系之一
。
源自细胞及微生物培养生产的生物制品含有特定杂质，包括宿主蛋白及
DNA
残留，相关研究表明，生物制品中寄主
DNA
具有潜在致瘤和传染风险，也有可能造成基因插入突变，因此，对寄主细胞
DNA
进行检测和清除，可以提高蛋白药物的纯度和质量，保证其临床应用的安全性和有效性
。
现有的检测方法存在检验周期较长
、
操作步骤繁复
、
依赖大型设备等问题，难以达到现场快速检测
。
因此，克服现有检测方法的局限，引入前沿技术，开发出准确
、
快速
、
便捷
、
灵敏
、
特异的生物制品中毕赤酵母残留
DNA
检测方法具有重大意义
。
[0004]目前在检测寄主细胞残留
DNA
方面的检测方法包括
DNA
探针杂交法
、
荧光染色法及定量
PCR
法等
。DNA
探针杂交法是利用特异性探针与供试品
DNA
进行杂交，然后通过显色的方法来判断
DNA
残留量
。
但是这个方法存在检测时间长，易产生假阳性的缺点
。
荧光染料法是通过荧光染料与
DNA
进行特异性结合，然后在特定激发光下来判读残留
DNA
的浓度范围，但是这种方法特异性较差
。
定量
PCR
法比较精准，但是这种方法依赖于大型设备，需要在实验室内进行
。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服传统生物药品中毕赤酵母残留
DNA
检测的技术缺陷，提供一种用于可视化检测毕赤酵母残留
DNA
的
pfAgo
检测试剂盒及其用途
。
[0006]为此，本专利技术采用的技术方案如下：
[0007]本专利技术首先提供了一种用于可视化检测毕赤酵母残留
DNA
的
pfAgo
检测试剂盒，所
述试剂盒包括：
[0008]RPA
扩增引物，其包括
SEQ ID No.1
序列所示的
P
‑
RPA
‑
F
和
SEQ ID No.2
序列所示的
P
‑
RPA
‑
R
；
[0009]三条5’
磷酸基修饰的
gDNA
，其序列分别如
SEQ ID No.3、SEQ ID No.4
和
SEQ ID No.5
所示；
[0010]两端修饰有
FAM
和
BHQ1
的
ssDNA reporter
，
ssDNA Reporter
序列如
SEQ IDNo.6
所示；
[0011]PfAgo
蛋白
。
[0012]本专利技术还提供了一种利用
PfAgo
体系可视化检测生物药品中毕赤酵母残留
DNA
的方法，包括如下步骤：
[0013]步骤一：提取生物药品待测样本中的
DNA
，对其进行
RPA
扩增；
[0014]步骤一中
RPA
扩增所用引物包括：
[0015]P
‑
RPA
‑
F
，即序列表
SEQ ID No.1
序列：
[0016]5’‑
TCTGGTTCGTCTGCTATGGCCCTGCAAAC
‑3’
；
[0017]P
‑
RPA
‑
R
，即序列表
SEQ ID No.2
序列
:
[0018]5’‑
CAAAGGGAGGTAAACAAAGGCAAACAAA
‑3’
。
[0019]步骤二：将
ssDNA reporter、PfAgo
蛋白和三条5’
磷酸基修饰的
gDNA、
与所述步骤一得到的扩增产物混合，进行
PfAgo
酶切反应；
[0020]所述
ssDNA reporter
序列如下：
[0021]5’‑6‑
FAM
‑
cgcaccTTCCCGTCCGATCAACTGggtgcg
‑
BHQ1
‑3’
；
[0022]三条
gDNA
的序列如下：
[0023]P
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
用于可视化检测毕赤酵母残留
DNA
的
pfAgo
检测试剂盒，其特征在于包括：
RPA
扩增引物，其包括
SEQ ID No.1
序列所示的
P
‑
RPA
‑
F
和
SEQ ID No.2
序列所示的
P
‑
RPA
‑
R
；三条5’
磷酸基修饰的
gDNA
，其序列分别如
SEQ ID No.3、SEQ ID No.4
和
SEQ ID No.5
所示；两端修饰有
FAM
和
BHQ1
的
ssDNA reporter
，
ssDNA Reporter
序列如
SEQ ID No.6
所示；
PfAgo
蛋白
。2.
根据权利要求1所述的
pfAgo
检测试剂盒，其特征在于，所述
PfAgo
用量为2μ
M
；
gDNA
的浓度2μ
M
，三条
gDNA
等摩尔量；
ssDNA reporter
的浓度为1‑2μ
M。3.
权利要求1或2所述的
pfAgo
检测试剂盒在检测生物药品中毕赤酵母残留
DNA
中的应用
。4.
一种利用
PfAgo
体系可视化检测生物药品中毕赤酵母残留
DNA
的方法，其特征在于包括如下步骤：步骤一：提取生物药品待测样本中的
DNA
，对其进行
RPA
扩增；步骤二：将
ssDNA reporter、PfAgo
蛋白和三条5’
磷酸基修饰的
gDNA、
与所述步骤一得到的扩增产物混合，进行
PfAgo
酶切反应；步骤三：在
482nm
‑
518nm
的蓝光投射仪下对酶切后的反应体系进行荧光检测，若显示荧光，则判断待测样本中含有毕赤酵母残留
DNA
；否则，待测样品中不含毕赤酵母残留
DNA。5.
如权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤一中
RPA
扩增所用引物包括：
P
‑
RPA
‑
F
：5’‑

【专利技术属性】
技术研发人员：孙凯，刘妍，马宁，付贤树，叶子弘，俞晓平，
申请(专利权)人：中国计量大学，
类型：发明
国别省市：