一种全长质粒质控的方法技术

本发明专利技术公开了一种全长质粒质控的方法

【技术实现步骤摘要】
一种全长质粒质控的方法


[0001]本专利技术属于生物医学
，涉及一种全长质粒质控的方法
。

技术介绍

[0002]质粒广泛应用于生物学领域，其可进行基因递送
、mRNA
合成或直接用于生产质粒
DNA
疫苗，也是基因治疗和细胞治疗中包装病毒载体的基础，如腺病毒
(AdV)、
腺相关病毒
(AAV)
和慢病毒
(LV)。
因此，对质粒序列进行精确验证及污染控制对于生产高质量病毒载体等临床治疗产品是非常有必要的
。
[0003]目前，有很多商业化服务可以完成对质粒序列的鉴定，其中最常用的是
Sanger
测序，虽然该技术准确性较高，但测序读长较短
(
通常
<1kb)
，不能验证质粒全长序列是否正确，且无法进行高通量测序
。
此外，通过调查
Sanger
测序峰图也很难辨别出质粒的少量污染情况
。
使用
>Illumina<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种全长质粒质控的方法，其特征在于，所述方法包括：利用靶向质粒骨架序列的
Cas9/sgRNA
复合物将环状质粒线性化，然后进行纳米孔测序得到原始数据，将得到的原始数据进行预处理后进行数据分析，得到全长质粒的质控信息
。2.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶向质粒骨架序列的
Cas9/sgRNA
复合物中的
sgRNA
的核酸序列包括
SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.15
所示的序列
。3.
根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述数据分析的流程包括预处理数据分流及可视化分析
、
测序完整性分析
、
数据预警分析
、
质粒中存在的插入
、
缺失及突变检测分析和污染鉴定分析
。4.
根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述预处理数据分流及可视化分析包括：根据
Cas9/sgRNA
切割位点上下游
45
‑
50bp
序列生成6个
17ntgrep
抓取序列，对原始数据进行分流，将原始数据与对应的参考序列进行排序，利用
IGV
可视化工具获得可视化图片
。5.
根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述测序完整性分析包括：读取每个质粒分流出来的数据，以载体参考序列长度为准，测序序列长度在参考序列长度
90
‑
110
％范围内视为完整，完整
reads
数占该质粒总
reads
数的比例视为完整率
。6.
根据权利要求3‑5中任一项所述的方法，其特征在于，所述数据预警分析包括：将测序数据与参考序列进行比对，设置差异阈值，超过差异阈值的数据判定为预警数据，反之认定为正常数据；所述差异阈值为与参考序列全长具有
90
％相似度
。7.
根据权利要求3‑6中任一项所述的方法，其特征在于，所述插入
、
缺失及突变检测分析包括：对预警处理后的正常数据提取共识序列，将共识序列与参考序列进行比对，并自动识别异常点，记录存在突变
、
插入
、
缺失的区域
。8.
根据权利要求3‑7中任一项所述的方法，其特征在于，所述污染鉴定分析包括：分析预警数据，辨别与原始质粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：张孝兵，杨智学，张智康，张健萍，
申请(专利权)人：中国医学科学院血液病医院中国医学科学院血液学研究所，
类型：发明
国别省市：