一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵产制造技术

本申请公开了一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵产

【技术实现步骤摘要】
一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵产
β
‑
熊果苷方法


[0001]本申请涉及生物化工
，具体涉及一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵产
β
‑
熊果苷方法
。

技术介绍

[0002]熊果苷（
Arbutin
）是广泛存在于植物中的一种对苯二酚糖苷类化合物，它分为
α
‑
熊果苷（4‑
羟基苯基
‑
α
‑
D
‑
吡喃葡萄糖苷）和
β
‑
熊果苷（4‑
羟基苯基
‑
β
‑
D
‑
吡喃葡萄糖苷）两种构型
。
β
‑
熊果苷存在于天然植物中，也可通过化学法获得，
α
‑
熊果苷则主要通过生物转化法获得
。
二者均能抑制人体内酪氨酸酶的活性，从而干扰黑色素的形成，起到美白的作用
。
此外，熊果苷还具有抗氧化
、
消炎和抗癌的作用，因此被广泛应用于医药和化妆品等行业
。
随着人们生活水平的提高，熊果苷的需求量逐年增加，具有重要的经济价值和广泛的市场前景
。
[0003]目前，熊果苷可以通过植物提取法
、
化学合成法
、
生物转化法和利用工程菌发酵的方法获得，工业生产
β
‑
熊果苷主要以化学合成法为主
>。
化学合成法以添加了保护基的葡萄糖和对苯二酚为原料，进行糖苷化反应，然后脱去保护基从而获得熊果苷
。
此方法步骤繁琐
、
反应条件要求苛刻且合成的熊果苷立体选择性较差，反应产物一般为
β
‑
型和少量
α
‑
型的混合物，且无法高效专一的合成美白效果更佳的
α
‑
熊果苷
。
与化学法相比，生物转化法对环境更加友好，反应条件更加温和
。
目前生物转化法合成熊果苷的研究已取得一定进展，但该方法需要在反应体系中额外添加对苯二酚等底物，且对苯二酚本身对细胞具有一定的毒害作用，浓度过高时会抑制细胞的活性，不利于熊果苷产量的进一步提升
。
而与化学法和生物转化法相比，微生物发酵法以廉价的葡萄糖作为碳源合成
β
‑
熊果苷，具有成本低
、
环境污染小等优点
。
目前已有利用大肠杆菌
、
解脂假丝酵母和假单胞菌从头合成
β
‑
熊果苷的报道，但产量均较低，无法满足工业化大规模生产的需要
。
[0004]为了更好地解决这一些列的难题，从而满足熊果苷在市场上日益增长的需求，因此构建微生物工厂从头生产熊果苷成为了目前的研究热点，而构建高产
β
‑
熊果苷底盘微生物细胞工厂便成为了一个亟待解决的问题
。
在现研究阶段可得知，谷氨酸棒杆菌（
Corynebacterium glutamicum
）是一种对人体无毒的生物安全细菌，已被广泛应用于各种氨基酸及其衍生物的生产，在
β
‑
熊果苷的生产应用中具有极大的潜力
。
野生型的谷氨酸棒杆菌不能天然生产
β
‑
熊果苷，但经过基因工程和代谢工程等手段改造的重组谷氨酸棒杆菌在作为
β
‑
熊果苷的生产菌株时具有以下优点：（1）谷氨酸棒杆菌是一种对人体无毒无害的生物安全细菌；（2）谷氨酸棒杆菌是革兰氏阳性菌，对高浓度的产物具有较强的耐受能力；（3）谷氨酸棒杆菌是模式菌株，其生理生化特征和代谢途径均有深入了解，改造手段也比较成熟
。
但目前，仍未见利用谷氨酸棒杆菌从头发酵生产
β
‑
熊果苷的相关技术报道，因此成了一个急需突破的技术问题
。

技术实现思路

[0005]本申请的目的在于：为解决上述
技术介绍
中反应的问题，本申请提供了一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵产
β
‑
熊果苷方法
。
[0006]本申请为了实现上述目的具体采用以下技术方案：一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵产
β
‑
熊果苷方法，由种子培养基和发酵培养基配合完成，且包括以下步骤：
S1、
在谷氨酸棒杆菌
ATCC 13032
中引入
UbiC、MNX1
和
AS
基因，构建
β
‑
熊果苷合成途径，获得重组谷氨酸棒杆菌
13032
‑
MU
‑
A
；
S2、
敲除控制分支酸合成芳香族氨基酸的
csm
和
trpE
基因，切断竞争代谢途径；
S3、
引入
P
sod
强启动子，强化表达莽草酸途径关键酶的编码基因
aroG2
，获得重组谷氨酸棒杆菌
13032
‑
MU
‑
A, Δ
csm
Δ
trpE, P
sod
aroG2(
命名为
AR09)
；
S4、
对重组谷氨酸棒杆菌进行好氧发酵验证
β
‑
熊果苷产量，所接种发酵成分不低于
20 %
体积，发酵温度最低为
32 ℃
，摇床转速为不低于
250 rpm
，发酵时间不低于 48 h。
[0007]进一步地，所述
UbiC
基因以及
MNX1
基因由表达质粒
pXMJ19
进行共表达而获得，所述
AS
基因由表达质粒
pEC
‑
XK99E
进行表达而获得
。
[0008]进一步地，所述
csm
基因和
trpE
基因由谷氨酸棒杆菌自6杀性质粒
pK18mobsacB
进行敲除而获得
。
[0009]进一步地，所述
P
sod
强启动子通过构建
pK18
‑
P
sod
aroG2
重组质粒以引入
aroG2
基因
。
[0010]进一步地，还包括以下步骤：
S5、
将所述重组谷氨酸棒杆菌
13032
‑
MU
‑
A
移至添有
12.5 mg/L
氯霉素和
12.5 m本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵产
β
‑
熊果苷方法，其特征在于，由种子培养基和发酵培养基配合完成，且包括以下步骤：
S1、
在谷氨酸棒杆菌
ATCC 13032
中引入
UbiC、MNX1
和
AS
基因，构建
β
‑
熊果苷合成途径，获得重组谷氨酸棒杆菌
13032
‑
MU
‑
A
；
S2、
敲除控制分支酸合成芳香族氨基酸的
csm
和
trpE
基因，切断竞争代谢途径；
S3、
引入
P
sod
强启动子，强化表达莽草酸途径关键酶的编码基因
aroG2
，获得重组谷氨酸棒杆菌
13032
‑
MU
‑
A, Δ
csm
Δ
trpE, P
sod aroG2 (
命名为
AR09)
；
S4、
对重组谷氨酸棒杆菌进行好氧发酵验证
β
‑
熊果苷产量，所接种发酵成分不低于
20 %
体积，发酵温度最低为
32 ℃
，摇床转速为不低于
250 rpm
，发酵时间不低于 48 h。2.
根据权利要求1所述的一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵产
β
‑
熊果苷方法，其特征在于，所述
UbiC
基因以及
MNX1
基因由表达质粒
pXMJ19
进行共表达而获得，所述
AS
基因由表达质粒
pEC
‑
XK99E
进行表达而获得
。3.
根据权利要求1所述的一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵产
β
‑
熊果苷方法，其特征在于，所述
csm
基因和
trpE
基因由谷氨酸棒杆菌自杀质粒
pK18mobsacB
进行敲除而获得
。4.
根据权利要求1所述的一种利用重组谷氨酸棒杆菌发酵产
β
‑
熊果苷方法，其特征在于，所述
P
sod
强启动子通过构建
pK18
‑
P
sod
aroG2
重组质粒以引入
aroG2
基因
。5.
根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：张斌，许可心，勾可新，
申请(专利权)人：江西农业大学，
类型：发明
国别省市：