基于制造技术

本发明专利技术提出了基于

【技术实现步骤摘要】
基于LAMP
‑
CRISPR/Cas12a技术检测大丽轮枝菌的方法


[0001]本专利技术涉及微生物检测
，特别涉及基于
LAMP
‑
CRISPR/Cas12a
技术检测大丽轮枝菌的方法
。

技术介绍

[0002]棉花是锦葵科
(Malvaceae)
棉属
(Gossypium)
植物，原产亚热带
。
棉花是世界上重要的经济作物之一
。
我国是世界前三的棉花生产国，已形成了以新疆为主，包括长江流域
、
黄河流域的三大产棉区
。
棉花黄萎病的发生一般可使棉花产量降低
20
％
‑
30
％，最高可达
60
％
。
棉花黄萎病在棉花生产中是为害极大，且具毁灭性的病害，被称为棉花上的
"
癌症
"。
病害一旦发生难以根除，苗期引起大量死苗，成株期蕾铃大量脱落
、
植株枯死，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
基于
LAMP
‑
CRISPR/Cas12a
技术检测大丽轮枝菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)
提取待测样品的基因组
DNA
；
(2)
采用
LAMP
引物对步骤
(1)
中提取的待测样品的基因组
DNA
在
60
～
64℃
条件下进行靶标
DNA
扩增反应
45
～
50min
，得到
LAMP
反应产物；
(3)
使用
LAMP
反应产物，
Cas12a
蛋白，荧光基团和荧光淬灭基团标记的
ssDNA
探针，
crRNA
分子，建立
LAMP
‑
CRISPR/Cas12a
检测体系，
36
～
38℃
反应
30
～
60min
，得到
LAMP
‑
CRISPR/Cas12a
反应产物；所述
crRNA
分子的核苷酸序列如
SEQ ID NO.7
所示；
(4)
将得到的
LAMP
‑
CRISPR/Cas12a
反应产物进行荧光强度检测，阳性为荧光，阴性无荧光
。2.
根据权利要求1的基于
LAMP
‑
CRISPR/Cas12a
技术检测大丽轮枝菌的方法，其特征在于，
CRISPR/Cas12a
检测体系为：
0.8
～
1.2
μ
L 10
×
NEBuffer r2.1
，
0.5
～
0.7
μ
L 1
μ
M crRNA
，
0.5
～
0.7
μ
L 1
μ
M EnGen Lba Cas12a(Cpf1)
，
0.4
～
0.6
μ
L RNase inhibitor
，
0.8
～
1.2
μ
L 2
μ
MFAM
‑
BHQ1
标记
ssDNA
报告基团，
1.8
～
2.2
μ
L 2.1M
海藻糖溶液，无酶水补足7～8μ
L。3.
根据权利要求1的基于
LAMP
‑
CRISPR/Cas12a
技术检测大丽轮枝菌的方法，其特征在于，所述
crRNA
的获得方法，包括如下步骤：
S1
：用合成相应的含
T7
启动子
、
重复序列和间隔序列的
Oligo
短链退火，得到指导
RNA
的
DNA
模板；步骤
S1
的反应体系为：
15
～
25
μ
L、50
μ
M DNAoligo A
，
15
～
25
μ
L、50
μ
M DNAoligo B
，
15
～
25
μ
L 5
×
退火缓冲液和
35
～
45
μ
L
无酶水；步骤
S1
的退火的反应程序为：
94
～
96℃
维持
1.5
～
2.5min
，而后每
85
～
95s
下降
1℃
，降至
24
～
26℃
；
S2、
以步骤
S1
制备的指导
RNA
的
DNA
模板为体外模板，使用
T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit
进行转录，在
36
～
38℃
的条件下反应过夜，进行体外转录，合成指导
RNA
，纯化稀释，得所述
crRNA
；体外转录合成的反应体系为：
0.8
～
1.2
μ
L
指导
RNA
的
DNA
模板，
2.8
～
3.2
μ
L NTP Mix
，
0.8
～
1.2
μ
L T7 RNAPolymerase Mix
，无酶水补足至
30
～
35
μ
L
；反应过夜后加入
40
～
45
μ
L
无酶水，
2.8
～
3.2
μ
L DNaseⅠ，
36
～
38℃
反应
15
～
20min。4.
根据权利要求1的基于
LAMP
‑
CRISPR/Cas12a
技术检测大丽轮枝菌的方法，其特征在于，步骤
(2)
中，所述
LAMP
引物包括上游外引物<...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈代朋，方雨萧，张玉芳，郑丽，刘文波，缪卫国，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：