一种盐胁迫下延缓海滨雀稗叶片延缓叶片衰老的方法技术

本发明专利技术公开了一种盐胁迫下延缓海滨雀稗叶片延缓叶片衰老的方法；其操作步骤：植物材料培养和盐胁迫处理；

【技术实现步骤摘要】
一种盐胁迫下延缓海滨雀稗叶片延缓叶片衰老的方法


[0001]本专利技术涉及植物科学领域，涉及了一种盐胁迫下延缓海滨雀稗叶片延缓叶片衰老的方法；具体的是，涉及了一种降低盐胁迫下海滨雀稗叶片茉莉酸含量且延缓叶片衰老的方法
。

技术介绍

[0002]当植物遭受到环境胁迫时会产生并积累活性氧
(ROS)
；高浓度的
ROS
对植物细胞具有毒害作用，但低浓度的
ROS
则作为信号物质调节植物对非生物胁迫的响应；已有的研究表明，质膜
NADPH
氧化酶是一类跨膜氧化还原酶，在应答非生物胁迫反应和调节植物的生长发育中发挥着非常重要的作用；近年来的研究强调，质膜
NADPH
氧化酶介导的
H2O2
在植物感应和响应盐胁迫中起着关键地正向调控作用；不同于甜土植物，盐生植物通过长期地进化已经建立了强大而精密的的耐盐机制；有研究证明，盐生植物海滨雀稗根系会通过主动吸收
Na
+
的方式促进根源
H2O2的产生，从而激活抗氧化系统和脂膜适应性重塑等关键耐盐策略，以提高海滨雀稗的耐盐性；此外，最新研究表明，根源
NADPH
氧化酶介导的
H2O2还参与调控植物衰老激素脱落酸
(ABA)
诱导的叶片衰老；
[0003]茉莉酸
(JA)
由环境因素控制的植物衰老激素且对叶片衰老起正向调控作用；盐胁迫会诱导根系中内源
JA
的产生和积累，导致叶片中
JA
含量上升，叶绿体降解，促使叶片衰老的发生；但是，目前盐驱动下根源
H2O2是否参与调控
JA
内源稳态平衡以延缓叶片衰老的发生，尚未见报道
。

技术实现思路

[0004]针对上述问题，本专利技术为了解决现有技术中的问题，而提出了一种盐胁迫下延缓海滨雀稗叶片延缓叶片衰老的方法；其目的是在于证明海滨雀稗根源
H2O2通过影响茉莉酸合成从而延缓盐胁迫下的叶片衰老
。
[0005]本专利技术的技术方案是：本专利技术所述的一种盐胁迫下延缓海滨雀稗叶片延缓叶片衰老的方法，其具体的操作步骤如下：
[0006]步骤
(1)、
植物材料培养和盐胁迫处理；具体是；
[0007]选取两个月大小和生长一致的海雀稗材料匍匐茎种植于底部有孔的育苗杯中；在
pH
＝
6.0
的霍格兰溶液中水培，每7天更换一次溶液；
[0008]将海雀稗材料匍匐茎生长到第
14
天，放入植物培养箱进行盐处理；
[0009]其中，所述植物培养箱光照周期为
16h/8h(
光照
/
黑暗
)
，温度为
30℃/28℃(
白天
/
夜间
)
，相对湿度为
70
％，光强为
1000lx
；
[0010]后将盐处理的海雀稗材料和对照处理的海雀稗材料分别在添加或不添加
400mM NaCl
的水培塑料容器中进行；
NaCl
浓度每天逐渐增加
100mM
，直到达到目标浓度
400mM
；在盐处理的第五天，分别从盐处理和对照处理的海雀稗材料中取样；为了研究
NADPH
氧化酶介导根源
H2O2
的实验，在
400mM NaCl
溶液中添加
100
μ
M
二苯基氯化碘
(DPI)
；
[0011]处理
5d
后，收集根系用于后续分析
。
每个处理设置6个生物学重复；使用3至6个生物重复进行如下实验；
[0012]步骤
(2)、H2O2含量测定；具体是：采用
H2O2测定试剂盒含量测定根源
H2O2含量的变化；
[0013]步骤
(3)、DAB
染色；具体是：将分离的根系放入浓度为
0.5mg/ml
的
DAB
染液中，在室温
(
通常是
25
‑
30℃)
下避光中染色
2h
至
6h
；最后用纯水冲洗5次后，拍照并室温保存；
[0014]步骤
(4)、
叶绿素含量和
Fv/Fm
值测定；具体是：总叶绿素含量
(Chl(a+b))
测定采用分光光度法；
[0015]用蒸馏水冲洗干净叶片后用滤纸吸干表面水分，快速称取剪碎的鲜叶片3份，每份
2g
，放入加有少量石英砂的研钵中充分研磨成浆，再加入乙醇
10ml
，继续研磨至组织变白；
[0016]在漏斗中过滤后，用乙醇将滤液定容
100ml
；
[0017]分别在
665nm、645nm
和
652nm
下测定吸光度，以
95
％乙醇为空白对照；
Chl(a+b)
＝
A625/35.5
×
V
÷
1000
×
W
；
[0018]步骤
(5)、
脂质组学数据测定和分析；具体是：取约
100mg
叶片和根系样本，加入液氮并研磨成粉末，用甲醇：蒸馏水
(1
：
1)
提取脂质
。
使用
Nexera UHPLC LC
‑
30A
系统
(Shimadzu,Kyoto,Japan)
和
TripleTOF5600+(AB SCIEX
TM
)
质谱仪进行脂质的
LC
‑
MS
分析
。
柱温设置为
40℃
；
[0019]流动相为
0.1
％
HCOOH
‑
H2O(A)
‑
乙腈
(B)
，流速为
0.3mL/min
，梯度洗；
[0020]所述
TripleTOF5600+(AB SCIEX
TM
)
质谱仪中
ESI
源条件设置如下：离子源
Gas1(Gas 1)
：
50
，离子源
Gas2(Gas 2)
：
50
，幕气
(CUR)
：
25
，源温度：
500℃/450℃(
正离子
/
负离子
)...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种盐胁迫下延缓海滨雀稗叶片延缓叶片衰老的方法，其特征在于，其具体的操作步骤如下：步骤
(1)、
植物材料培养和盐胁迫处理；步骤
(2)、H2O2含量测定；步骤
(3)、DAB
染色；步骤
(4)、
叶绿素含量和
Fv/Fm
值测定；步骤
(5)、
脂质组学数据测定和分析；步骤
(6)、
内源激素水平分析；步骤
(7)、
实时定量
PCR
技术分析基因表达水平；步骤
(8)、
转录组学数据及分析
。2.
根据权利要求1所述的一种盐胁迫下延缓海滨雀稗叶片延缓叶片衰老的方法，其特征在于，在步骤
(1)
中，所述植物材料培养和盐胁迫处理具体是；选取两个月大小和生长一致的海雀稗材料匍匐茎种植于底部有孔的育苗杯中；然后置于
pH
＝
6.0
的霍格兰溶液中水培，每7天更换一次溶液；待海雀稗材料匍匐茎生长到第
14
天，放入植物培养箱进行盐处理；后将盐处理后的海雀稗材料和对照处理的海雀稗材料分别在添加或不添加
400mM NaCl
的水培塑料容器中进行；
NaCl
浓度每天逐渐增加
100mM
，直到达到目标浓度
400mM
；其中，在盐处理的第五天，分别从盐处理和对照处理的海雀稗材料中取样；为研究
NADPH
氧化酶介导根源
H2O2
的实验，在
400mM NaCl
溶液中添加
100
μ
M
二苯基氯化碘；处理
5d
后，收集根系用于后续分析；每个处理设置6个生物学重复；使用3至6个生物重复进行实验
。3.
根据权利要求2所述的一种盐胁迫下延缓海滨雀稗叶片延缓叶片衰老的方法，其特征在于，所述植物培养箱的光照周期为：光照：
16h
，黑暗：
8h
；温度为：白天：
30℃
，夜间：
28℃
；相对湿度为：
70
％，光强为：
1000lx。4.
根据权利要求1所述的一种盐胁迫下延缓海滨雀稗叶片延缓叶片衰老的方法，其特征在于，在步骤
(2)
中，所述
H2O2含量测定具体是：采用
H2O2测定试剂盒含量测定根源
H2O2含量的变化
。5.
根据权利要求1所述的一种盐胁迫下延缓海滨雀稗叶片延缓叶片衰老的方法，其特征在于，在步骤
(3)
中，所述
DAB
染色具体是：将分离的根系放入浓度为
0.5mg/ml
的
DAB
染液中，在室温下避光染色
2h
至
6h
；最后用纯水冲洗5次后，拍照并室温保存
。6.
根据权利要求1所述的一种盐胁迫下延缓海滨雀稗叶片延缓叶片衰老的方法，其特征在于，在步骤
(4)
中，所述叶绿素含量和
Fv/Fm
值测定具体是：总叶绿素含量测定采用分光光度法：用蒸馏水冲洗干净叶片后用滤纸吸干表面水分，称取剪碎的鲜叶片3份，每份
2g
，放入加有石英砂的研钵中研磨成浆，再加入乙醇
10ml
，研磨至组织变白；在漏斗中过滤后，用乙醇将滤液定容
100ml
，分别在
665nm、645nm
和
652nm
下测定吸光度；以
95
％乙醇为空白对照，则：
Chl(a+b)
＝
A625/35.5
×
V
÷
1000
×
W。7.
根据权利要求1所述的一种盐胁迫下延缓海滨雀稗叶片延缓叶片衰老的方法，其特
征在于，在步骤
(5)
中，所述脂质组学数据测定和分析具体是：取约
100mg
叶片和根系样本，加入液氮并研磨成粉末提取脂质，使用
Nexera UHPLC LC
‑
30A
系统和
TripleTOF5600+
质谱仪进行脂质的
LC
‑
MS
分析；柱温设置为
40℃
，流动相为
0.1
％
HCOOH
‑
H2O(A)
‑
乙...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘玲，蔡丽蓉，许廷晨，王志勇，陆洋，王小山，严学兵，王琳，邬彩霞，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：