获得杀虫活性提高的制造技术

本发明专利技术公开了一种获得杀虫活性提高的

【技术实现步骤摘要】
获得杀虫活性提高的Vip3Aa突变体的方法及其突变体蛋白


[0001]本专利技术属于分子生物
，具体涉及一种通过点突变技术获得杀虫活性升高的
Vip3Aa
突变体蛋白的方法及由此得到杀虫活性升高的
Vip3Aa
突变体蛋白
。

技术介绍

[0002]苏云金杆菌
(Bacillus thuringiensis
，
Bt)
是一种重要的昆虫病原菌，来自
Bt
的杀虫蛋白是合成农药最成功的替代品，在农作物中表达
Bt
的蛋白可实现对不同害虫的特异性防治
。
目前
Bt
作物在全球种植面积已经超过
2.022
亿公顷
。Cry
类杀虫晶体蛋白
(insecticidal crystal proteins,ICP)
是
Bt
产生的最大一类的杀虫蛋白，也是
Bt
作物中表达的最主要的蛋白，在
20
世纪
90
年代已经开始商业化应用
。
但是，
Bt
作物的可持续利用受到害虫抗性发育的威胁，已经报道了多种
Bt
的
Cry
蛋白抗性昆虫
。
在农作物中表达至少两种在昆虫肠道中具有不同结合位点的
Bt
蛋白，可实现对目标害虫较持久的防治
。
因此，寻找与
Cry
蛋白毒素作用机理不同的杀虫毒素延缓害虫抗性发展迫在眉睫
。
[0003]营养期杀虫蛋白
(Vegetative insecticidal proteins
，
Vip)
是在苏云金杆菌的营养生长阶段产生的对多种鳞翅目害虫具有杀虫活性的蛋白
。Vip
蛋白被分为
Vip、Vpb1、Vpb4
和
Vpa
四类，其中
Vip
家族中的
Vip3A
类蛋白应用最为广泛，由于其与
Cry
蛋白没有序列同源性且具有不同的结合位点，已经被应用于
Bt
作物中以延缓害虫抗性的发展
。
[0004]Vip3A
类蛋白以约
89kDa
的原蛋白被分泌，经幼虫摄入后，被中肠蛋白酶水解激活
。Vip3A
蛋白被水解激活后才具有杀虫活性，且被水解激活前后该蛋白都是以四聚体形式存在
。
膜穿孔机制是被普遍认可的
Vip3A
类蛋白的杀虫机制，需要特异性受体参与，即
Vip3A
蛋白与靶标昆虫中肠刷状缘膜囊泡
(Brush border membrane vesicles
，
BBMVs)
上多种特定受体发生结合，最终插入细胞膜形成孔洞，通过形成稳定的离子通道来完成其杀虫作用
。Vip3Aa
蛋白包括五个结构域，结构域Ⅰ、
结构域Ⅱ、
结构域Ⅲ、
结构域Ⅳ以及结构域
Ⅴ
，其中结构域Ⅰ至结构域Ⅲ是蛋白四聚化所必需的，结构域Ⅲ包含三个折叠片层，与杀虫晶体蛋白中的
Cry
类蛋白结构域Ⅱ相似，在
Cry
蛋白结构域Ⅱ中，连接反向折叠的
loops
参与受体的识别
、
结合以及毒素的特异性
。
因此，基于结构相似功能相似的想法，专利技术人推测
Vip3Aa
蛋白的结构域Ⅲ的折叠片层中连接反向折叠的
loops(loop4
‑
5、loop9
‑
10、loop14
‑
15)
也可能具有相似的功能；氨基酸序列保守性最差的
loop12
‑
13
也可能跟受体识别有关，进而影响其膜穿孔功能和毒力
。

技术实现思路

[0005]针对上述领域中存在的问题，本专利技术提供了一种通过点突变技术获得杀虫活性提高的
Vip3Aa
突变体的方法及其突变体，利用该方法获得了杀虫活性提高的
Vip3Aa
突变体
。
[0006]本专利技术采用该方法，对
Vip3Aa
蛋白进行突变，获得
11
个突变体，该
11
个突变体对鳞翅目害虫草地贪夜蛾的杀虫活性有明显的提高
。
[0007]本专利技术发现了通过利用反向
PCR
技术对
Vip3Aa
的结构域Ⅲ中的
loop
区域进行全丙
氨酸突变，能够找到显著影响该蛋白对鳞翅目害虫草地贪夜蛾的杀虫活性的
loop
区域，对该
loop
区域的氨基酸进行点突变能够提高
Vip3Aa
与草地贪夜蛾中肠
BBMVs
受体的结合能力，从而增加该蛋白对鳞翅目害虫草地贪夜蛾的杀虫活性
。
[0008]基于此，一方面，本专利技术提供了一种通过点突变技术获得杀虫活性提高的
Vip3Aa
突变体的方法
。
[0009]所述方法利用点突变技术在基于单点突变的基础上进行了组合突变
。
[0010]另一方面，本专利技术提供了杀虫活性提高的
Vip3Aa
突变体，所述突变体与野生型
Vip3Aa
蛋白相比，将野生型
Vip3Aa
蛋白的结构域Ⅲ中的
loop
区域对应的氨基酸进行了定点突变
。
[0011]所述定点突变位点包括结构域Ⅲ中的
loop4
‑5或
/
和
loop9
‑
10
或
/
和
loop12
‑
13
或
/
和
loop14
‑
15
对应的氨基酸
。
[0012]在一个实施方式中，所述
Vip3Aa
蛋白的结构域Ⅲ为对应于
SEQ ID No.1
所示序列的第
325
位到第
536
位氨基酸
。
[0013]在一个实施方式中，所述野生型
Vip3Aa
蛋白结构域Ⅲ中的
loop4
‑5对应于
SEQ ID No.1
所示序列的第
365
位到第
367
位氨基酸，
loop9
‑
10
对应于
SEQ ID No.1
所示序列的第
429
位到第<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种通过点突变技术获得杀虫活性提高的
Vip3Aa
突变体蛋白的方法，其特征在于，所述方法利用点突变技术在基于单点突变的基础上进行了组合突变，包括如下步骤：
S1
：分析野生型
Vip3Aa
蛋白结构域Ⅲ中可能影响其杀虫活性的
loop
区域；
S2
：对
S1
中分析获得的野生型
Vip3Aa
蛋白结构域Ⅲ中的
loop
区域构建全丙氨酸突变体，定位能够显著影响该蛋白杀虫活性的关键
loop
区域；
S3
：将
S2
中所述的能够显著影响
Vip3Aa
蛋白杀虫活性的关键
loop
区域对应的氨基酸进行点突变，并检测突变体蛋白对鳞翅目害虫草地贪夜蛾的杀虫活性，获得活性提高的突变体；
S4
：对
S3
中所述的杀虫活性提高的突变体进行组合突变，并检测组合突变体蛋白对鳞翅目害虫草地贪夜蛾的杀虫活性，获得杀虫活性提高的突变体
。2.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
S2
中，突变为
Vip3Aa
蛋白结构域Ⅲ中
loop
区域对应的氨基酸突变
。3.
根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
S3
中的突变体为
Vip3Aa
蛋白结构域Ⅲ中的
Vip3Aa
‑
S366T
氨基酸突变，或
/
和
Vip3Aa
‑
S366L
氨基酸突变，或
/
和
Vip3Aa
‑
N470K
氨基酸突变，或
/
和
Vip3Aa

【专利技术属性】
技术研发人员：侯晓月，李梦姣，茆成娟，蒋磊，李鑫，耿晓萌，
申请(专利权)人：江苏海洋大学，
类型：发明
国别省市：