一种高分辨率制造技术

本发明专利技术涉及一种高分辨率

【技术实现步骤摘要】
一种高分辨率RNA电泳方法


[0001]本专利技术属于生化分析领域，特别涉及一种高分辨率
RNA
电泳方法
。

技术介绍

[0002]凝胶电泳
(gel electrophoresis)
是检测
DNA、RNA
片段长度的常用方法，包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳
(PAGE)。
琼脂糖凝胶电泳可以分离
0.1
‑
25kbp
范围内的核酸片段，聚丙烯酰胺凝胶电泳对
500bp
以下的小片段分离效果较好，最高分辨率可达一个碱基
。
[0003]核酸骨架上磷酸基团中氢的电离平衡常数的负对数
pKa
约为6‑7，
pH
大于7时，磷酸的氢电离，所以核酸在中性至碱性
pH
中带负电，在电场中会从负极往正极移动
。
核酸在电场中的迁移速度主要与片段长度有关，但核酸的结构也对迁移速度有影响
。
核酸电泳中，测定片段长度的一个前提假设就是，所有核酸片段都呈线性，在一定长度范围内，迁移速度与片段长度成正比
。
但实际中核酸本身会折叠
、
弯曲，形成高级结构
。
比如双链环状闭合的质粒
DNA
会形成超螺旋，使其结构更紧凑，在电泳时会比相同长度的直链
DNA
迁移速度更快
。
单链的
RNA
可以形成更加复杂的结构，对迁移速度的影响更大
。
对这些样品，可以在电泳前增加预处理的步骤，使核酸的变成线性直链，以消除结构对迁移速度的影响
。
比如，电泳前用限制性内切酶将环状
DNA
切割成线性，或者加入变性剂使
RNA
无法形成分子内碱基配对
。
[0004]凝胶电泳中的两个主要成分是凝胶介质和电泳液
。
凝胶介质的孔隙大小决定了可分离片段的大小
。
电泳液传递了电场，并维持
pH
的稳定
。
琼脂糖凝胶电泳常用的电泳液是
TAE(Tris
‑
acetate
‑
EDTA)
和
TBE(Tris
‑
borate
‑
EDTA)
，这些电泳液的配方从分子生物学发展之初一直延用至今
。
当时的研究人员可能并没有对其中的成分进行系统优化，加上当时对其中的一些原理认识不足，虽然这些方法效果尚可，但并不是最完美的方法
。
[0005]目前一般实验室
RNA
电泳的方法是甲醛
MOPS
琼脂糖电泳
。
这个方法需要用甲醛和甲酰胺将
RNA
变性成单链，凝胶制备时也要加入2％甲醛，所以需要在通风橱中操作
。
所用的
MOPS
缓冲液
pH
为7，而不是一般的
pH8
，以避免碱性对
RNA
的降解
。
但缓冲液又不能是酸性，因为核酸在酸性
pH
下不带电，无法在电场中移动
。
另外还有用乙二醛使
RNA
变性的电泳方法，该方法的试剂和步骤也较复杂
。
[0006]因为甲醛
MOPS
琼脂糖电泳要用到有毒试剂，而且步骤繁琐，所以通常会直接用
TAE
琼脂糖电泳来检测
RNA
，电泳前也不将
RNA
变性
。
但
TAE
琼脂糖对
RNA
的分离效果并不好，因为
TAE
电泳液的离子浓度较高，
RNA
在里面可以形成二级结构，即使是未降解的
RNA
也常常有弥散或拖尾现象
。
这对只有两个主要条带的动物
RNA
影响不大，即使因为二级结构有略微弥散，仍能分辨出
18s
和
28s rRNA
两个条带，但植物叶片总
RNA
里的片段种类多，各种片段相互重叠形成弥散，很容易造成
RNA
降解的假象
。

技术实现思路

[0007]现有技术精度不高
、
步骤繁琐
、
需要用到有毒试剂
、
电泳时间长
、
成本偏高
。
[0008]为了解决上述技术问题，本专利技术公开一种高分辨率
RNA
电泳方法，本专利技术的方案是，在低离子浓度下将
RNA
变性，然后在低离子浓度的硼酸钠电泳液
(sodium borate buffer
，
SB
电泳液
)
中电泳，依次经过以下步骤：
[0009]一种高分辨率
RNA
电泳方法，包括以下步骤：
[0010]步骤一：
RNA
预处理
[0011]RNA
变性预处理有两种选择
[0012]选择1：溶于纯水的
RNA
直接加热；
[0013]选择2：
RNA
与甲酰胺混合后加热；
[0014]步骤二：制胶
[0015]琼脂糖加低离子浓度电泳液，加热融化混匀后倒入模具中，等待凝固；
[0016]步骤三：电泳
[0017]在电泳槽中加入低离子浓度电泳液，将凝固后的胶放入电泳槽，使电泳液刚好没过凝胶，然后上样进行电泳；
[0018]步骤四：凝胶成像
[0019]在凝胶成像仪中观察并拍照
。
[0020]优选地，所述步骤一中，两种
RNA
预处理方法的温度条件为
65℃
加热
5min
，加热后立即置于冰上快速冷却
。
[0021]优选地，所述步骤一中，
RNA
预处理选择2中，甲酰胺的体积为
RNA
的
1.5
倍
。
[0022]优选地，所述步骤二
、
三中，所用电泳液为低离子浓度电泳液，包括但不限于硼酸钠电泳液
(SB)、
硼酸锂电泳液
(LB)、
醋酸锂硼酸电泳液
(LAB)
，这些电泳液离子浓度小于
10mM
，而一般的电泳液，如
TAE、TBE、MOPS
电泳液，离子浓度都大于
50mM。。
[0023]优选地，所述步骤二中，
SB
电泳液的配制方法为：
200mM
的氢氧化钠和...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种高分辨率
RNA
电泳方法，包括以下步骤：步骤一：
RNA
预处理
RNA
变性预处理有两种选择选择1：溶于纯水的
RNA
直接加热；选择2：
RNA
与甲酰胺混合后加热；步骤二：制胶琼脂糖加低离子浓度电泳液，加热融化混匀后倒入模具中，等待凝固；步骤三：电泳在电泳槽中加入低离子浓度电泳液，将凝固后的胶放入电泳槽，使电泳液刚好没过凝胶，然后上样进行电泳；步骤四：凝胶成像在凝胶成像仪中观察并拍照
。2.
根据权利要求1所述的高分辨率
RNA
电泳方法，其特征在于，所述步骤一中，两种
RNA
预处理方法的温度条件为
65℃
加热
5min
，加热后立即置于冰上快速冷却
。3.
根据权利要求1所述的
RNA
电泳方法，其特征在于，所述步骤一中，
RNA
预处理选择2中，甲酰胺的体积为
RNA
的
1.5
倍
。4.
根据权利要求1所述的高分辨率
RNA
电泳方法，其特征在于，所述步骤二
、
三中，所用电泳液为低离子浓度电泳液，包括但不限于硼酸钠电泳液
(SB)、
硼酸锂电泳液
(LB)、
醋酸锂硼酸电泳液
(LAB)
，电泳液离子浓度小于
10mM。5.
根据权利要求1所述的高分辨率
RNA
电泳方法，其特征在于，所述步骤二中，
SB
电泳液的配制方法为：
200mM
的氢氧化钠和
720mM
的硼酸混合后稀释
20
倍，稀释后电泳液
PH
为
7.5。6.
根据权利要求1所述的高分辨率
RNA
电泳方法，其特征在于，所述高分辨率
...

【专利技术属性】
技术研发人员：董志诚，刘晓斌，
申请(专利权)人：广州大学，
类型：发明
国别省市：