一种快速制造技术

本发明专利技术属于分子育种领域，涉及早熟油菜新品种的培育，特别是指一种快速

【技术实现步骤摘要】
一种快速、定向创制早熟油菜的方法及鉴定该早熟油菜的引物对


[0001]本专利技术属于分子育种领域，涉及早熟油菜新品种的培育，特别是指一种快速
、
定向创制早熟油菜的方法及鉴定该早熟油菜的引物对
。

技术介绍

[0002]油菜是中国主要种植的油料作物，也是世界上广泛种植的油料作物，在湖南的种植面积自
2015
年起便居全国第一位，是湖南省第二大作物
。
据统计，我国每年生产菜油约 350
万吨 ,
占总食用植物油的三分之一以上，是最重要的油料作物之一
。
我国油菜产量位居世界前列，是我国优质食用油和饲用蛋白的主要来源之一
。
早熟油菜生育期短，开花早，可有效利用冬闲田，解决稻油轮作茬口矛盾，因此，培育早熟油菜对油菜产业发展具有重要的现实意义
。
[0003]早花性状是研究油菜早熟的主要指标之一，作为植物开花路径中功能高度保守的开花基因，
FLC
和
TFL
均被证实为植物开花负调控因子
。FLC 是一个
MADS
‑
box 转录因子，可直接抑制
FT 和
SOC1 等植物关键开花基因的表达，阻止顶端分生组织从营养生长向生殖生长的转换，抑制植物的开花，是一个植物开花关键负调控因子，在低温需求型植物中，
FLC 的表达受到春化处理的抑制
。TFL
属于
PEBP
基因家族，研究表明r/>TFL
基因调控植物花序发育和开花时间，在光周期诱导过程中抑制植物成花，为植物开花负调控因子
。FLC 同源基因在白菜
、
甘蓝和甘蓝型油菜等芸薹属作物中均有多个拷贝，其中白菜中有
4 个，甘蓝中有
5 个，甘蓝型油菜中有
9 个；
TFL
在甘蓝型油菜中也具有5个同源基因
。
由于甘蓝型油菜参考基因组等信息不够丰富，且
BnaFLC
和
BnaTFL
成员多，难以对所有的成员进行深入和系统的研究，因此其研究进展较为落后
。
专利
CN 109112227 A
公开了油菜开花关键基因作为油菜生态型改良和早熟育种的分子标记及应用，该专利技术针对
BnaA10 .FLC
基因设计了分子标记用于辅助选择改良油菜花期
。
该专利实施例中记载了利用
FLC
基因延长花期最初可延长
20
天以上，利用半冬性油菜中双
11
号的
BnaA10.FLC
基因的分子标记可以提前获得早开花几天的油菜品种，该方法是通过杂交
、
连续回交合自交获得早开花或晚开花品种
。
为了进一步缩短油菜的开花周期，本课题组进行了长期的探索研究
。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术提出一种快速
、
定向创制早熟油菜的方法及鉴定该早熟油菜的引物对
。
[0005]本专利技术的技术方案是这样实现的：一种快速
、
定向创制早熟油菜的方法，实验原理如下：本申请通过一个载体同时靶向编辑油菜的
9 个
BnaFLC
或5个
BnaTFL
基因并结合小孢子培养技术及分子标记以实现快速
、
定向地创造早熟油菜
。
我们观察了野生型植株及编辑植株生长发育情况，
BnaFLC
或
BnaTFL
编辑植株均出现早花早熟的现象，这表明了该方法
个
BnaFLC
同源基因而创制的早熟油菜，包括分子标记
flc_T1
‑
F
分别与
BnaA02G00370D
‑
R、BnaA10G22080D
‑
R
和
BnaC03G04170D
‑
R
组合的三对引物，其中
flc_T1
‑
F
的核苷酸序列如
SEQ ID No.13
所示
、BnaA02G00370D
‑
R
的核苷酸序列如
SEQ ID No.14
所示
、BnaA10G22080D
‑
R
的核苷酸序列如
SEQ ID No.15
所示
、BnaC03G04170D
‑
R
的核苷酸序列如
SEQ ID No.16
所示
。
[0015]鉴定利用上述的方法创制的早熟油菜的引物对，所述引物对用于鉴定同时靶向5个
BnaTFL
同源基因而创制的早熟油菜，包括分子标记
BnaCnng10680D
‑
F
和
BnaCnng10680D
‑
R
，其中
BnaCnng10680D
‑
F
的核苷酸序列如
SEQ ID No.17
所示
、BnaCnng10680D
‑
R
的核苷酸序列如
SEQ ID No.18
所示
。
[0016]本专利技术具有以下有益效果：
1、
本申请通过一个载体同时定点靶向多个同源基因，由于甘蓝型油菜基因组信息和
BnaFLC
和
BnaTFL
家族成员数量限制，目前对油菜其基因功能的研究进展较缓，且缺少多个成员之间的相互效应分析
。
结合前人的研究，我们确定了甘蓝型油菜中的9个
BnaFLC
同源基因（
BnaA02g00370D、BnaA03g02820D、BnaA03g13630D、BnaA10g22080D、BnaC02g00490D、BnaC03g04170D、BnaC03g16530D、BnaC09g46540D、BnaC09g46500D
）和5个
BnaTFL
同源基因
(BnaC03g01440D、BnaC02g02900D、BnaAnng00810D、BnaA10g26300D、BnaCnng10680D)
，通过
ClustalW(https://www.genome.jp/tools
‑
bin/clustalw)
进行了序列比对并通过在线网站
CRISPR
‑
P v2.0(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2)
查询和选择能够同时靶向多个同源基因的靶序列，最终各确定了两个能够同时定点靶向...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种快速
、
定向创制早熟油菜的方法，其特征在于，步骤如下：（1）设计同时靶向9个
BnaFLC
同源基因或5个
BnaTFL
同源基因的
gRNA
序列；（2）根据步骤（1）的
gRNA
序列设计引物组，以
pCBC
‑
DT1T2 质粒为模板，进行
PCR
反应并回收产物；（3）将回收产物酶切克隆至
pHSE401
载体，获得
pHSE401
‑
T1T2
载体，验证成功后转至农杆菌感受态细胞；（4）经步骤（3）处理的农杆菌感受态细胞对受体品种的下胚轴进行侵染及共培养，获得
T0
代植株；（5）
T0
代植株经过小孢子培养获得的纯系品种即为早熟油菜品种
。2. 根据权利要求1所述的快速
、
定向创制早熟油菜的方法，其特征在于：所述步骤（1）中同时靶向9个
BnaFLC
同源基因的
gRNA
序列包括
FLC_Target1
和
FLC_Target2
，
FLC_Target1
的序列如
SEQ ID No.1
所示
、FLC_Target2
的序列如
SEQ ID No.2
所示，其中
NGG
为
PAM
位点
。3. 根据权利要求1所述的快速
、
定向创制早熟油菜的方法，其特征在于：所述步骤（1）中同时靶向5个
BnaTFL
同源基因的
gRNA
序列包括
TFL_Target1
和
TFL_Target2
，
TFL_Target1
的序列如
SEQ ID No.3
所示
、TFL_Target2
的序列如
SEQ ID No.4
所示，其中
NGG
和
CCN
为
PAM
位点
。4. 根据权利要求2所述的快速
、
定向创制早熟油菜的方法，其特征在于：步骤（2）中与靶向9个
BnaFLC
同源基因的
gRNA
序列相对应的引物组包括
FLC
‑
DT1
‑
BsF、FLC
‑
DT2
‑
BsR、FLC
‑
DT1
‑
F0
和
FLC
‑
DT2
‑
R0
，
FLC
‑
DT1
‑
BsF
序列如
SEQ ID No.5
所示
、FLC
‑
DT2
‑
BsR
序列如
SEQ ID No.6
所示
、FLC
‑
DT1
‑
F0
序列如
SEQ ID No.7
所示
、FLC
‑
DT2
‑
R0
序列如
SEQ ID No.8
所示
。5. 根据权利要求3所述的快速
、
定向创制早熟油菜的方法，其特征在于：步骤（2）中与靶向5个
BnaTFL
同源基因的
gRNA
序列相对应的引物组包括
TFL
‑
DT1
‑
BsF、TFL
‑
DT2
‑
BsR、TFL
‑
DT1
‑
F0
和
TFL
‑
DT2
‑
R0
，
TFL
‑
DT1
‑
BsF
序列如
SEQ ID No.9
所示
、TFL
‑
DT2
‑
BsR
序列如
SEQ ID No.10
所示
、TFL
‑
DT1
‑
F0
序列如
SEQ ID No.11
所示
、TFL
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：何昕，刘岩，刘蔚，王中华，李顺，王维平，钱论文，熊兴华，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：