一种数字制造技术

本发明专利技术涉及一种利用数字

【技术实现步骤摘要】
一种数字PCR检测KPC耐药基因的方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及一种利用数字
PCR
技术定量检测
KPC
耐药基因的试剂盒及检测方法，属于生物

。

技术介绍

[0002]碳青霉烯是有着广谱抗菌活性的一类
β
‑
内酰胺类抗生素，常作为治疗高产
Ampc
和超广谱的
β
‑
内酰胺酶的革兰阴性杆菌引起的感染的最有效的药物
。
但随着碳青霉烯类抗生素的广泛使用，细菌也逐渐获得对此类药物的耐药性
。
近年来，耐碳青霉烯的非发酵菌已成为医院感染的严重问题，而且耐碳青霉烯的肠杆菌细菌的报道也越来越多，这种耐碳青霉烯的革兰阴性杆菌的快速传播和流行正日益成为令人担忧的全球性问题
。
[0003]细菌对碳青霉烯类抗生素耐药主要原因是产生碳青霉烯酶，其包括
Ambler
分子分类的
A、B、D
三类酶
。
其中
A
类中的新增成员
KPC(Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase)
，因其能够水解除头霉素类以外几乎所有的
β
‑
内酰胺类抗菌药物而引起了世界各国抗感染专家和临床微生物工作者的极大关注
。
携带有
KPC
基因的细菌也被称为“超级细菌”。
由
KPC
型的“超级细菌
’
感染造成的暴发流行，往往使治疗陷入无药可用的境地，给临床抗感染治疗带来极大挑战
。
因此及时检测
KPC
基因，对细菌耐药表型进行监测，控制和杜绝超级细菌的爆发流行显得至关重要
。
[0004]目前主要利用分子生物学技术检测携带
KPC
基因的超级细菌，
PCR
的方法更是被誉为检测的“金标准”。
但普通
PCR
容易产生非特异性扩增，甚至会因为操作的原因出现假阳性或假阴性，而且普通
PCR
的结果判断需要对产物进行凝胶电泳分析，操作不够简化
。
目前尚缺乏一种灵敏度高
、
特异性好
、
操作简便的方法
。
[0005]数字
PCR(digital PCR
，
dPCR)
，即通过将一个样本分成大量等份，然后分配到不同的独立反应，每个独立反应单元至少包含一个拷贝的目标分子
(
核酸模板
)
，在每个独立反应的中分别对目的模板分子进行
PCR
扩增，然后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析，就可以推算出原始溶液的核酸浓度
。
目前数字
PCR
主要在癌症标志物稀有突变检测
、
致病微生物检测
、
基因表达分析以及拷贝数变异分析等科研领域有较广泛的应用，同时也可以与高通量测序无缝对接，验证测序结果
。
[0006]因此，本领域亟需一种利用数字
PCR
技术定量检测
KPC
耐药基因的试剂盒及检测方法
。

技术实现思路

[0007]本专利技术的所要解决的问题是：现有技术中缺少利用数字
PCR
技术定量检测
KPC
耐药基因的试剂盒及检测方法
。
[0008]为达到解决上述问题的目的，本专利技术所采取的技术方案是提供一种利用数字
PCR
技术定量检测
KPC
耐药基因的试剂盒及检测方法
。
[0009]本专利技术的第一方面，提供了一种利用数字
PCR
技术定量检测
KPC
耐药基因的检测方
法，包括以下步骤：
[0010]步骤1：先将
PCR Buffer(
含
Rox)、
引物对
、
探针和
DNA
模板充分融化，充分混匀，然后使用离心机离心至管底，放在冰上备用；
[0011]步骤2：反应体系配置，其中，
10
×
浓度的
PCR Buffer 2uL
，正向引物
(F
，
10uM)1uL
，反向引物
(R
，
10uM)1uL
，探针
(P
，
5uM)1uL
，
H20 13uL
，
DNA
模板
2uL
，混合均匀；
[0012]步骤3：微滴制备，使用
PCR
系统中的全自动上样仪将
20ul PCR
反应液均匀分散至芯片中；
[0013]步骤4：扩增，将芯片放置于扩增仪中，按该程序进行扩增，先在
95℃
温度下预变性
5min
；然后进行
45
个循环，其中每个循环依次进行
95℃
，
30s
和
56℃
，
45s
；
[0014]步骤5：芯片阅读，将扩增后的芯片放置于芯片阅读仪中，进行芯片阅读分析；
[0015]其中，
DNA
模板的序列如
SEQ ID NO 1
所示；
[0016]引物对的序列如
SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3
所示，包括正向引物和反向引物，其中所述正向引物结合于测试序列的第
304
‑
323
位；其中的反向引物结合于测试序列的第
420
‑
439
位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为
136bp
；
[0017]探针的序列如
SEQ ID NO 4
所示；
[0018]SEQ ID NO 1
为：
[0019]ACAGTGATAACGCCGCCGCCAATTTGTTGCTGAAGGAGTTGGGCGGCCCGGCCGGGCTGACGGCCTTCATGCGCTCTATCGGCGATACCACGTTCCGTCTGGACCGCTGGGAGCTGGAGCTGAACTCCGCCATCCCAGGCGATGCGCGCGATACCTCATCGCCGCGCGCCGTGACGGAAAGCTTACAAAAACTGACACTGGGCTCTGCACTGGCTGCGCCGCAGCGGCAGCAGTTTGTTGATTGGCTAAAGGGAAACACGACCGGCAACCACCGCATCCGCGCGGCGGTGCCGGCAGACTGGGCAGTCGGAGACAAA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种利用数字
PCR
技术定量检测
KPC
耐药基因的检测方法，包括以下步骤：步骤1：先将
10xPCR Buffer(
含
Rox)、
引物对
、
探针和
DNA
模板充分融化，充分混匀，然后使用离心机离心至管底，放在冰上备用；步骤2：反应体系配置，其中，
10
×
浓度的
PCR Buffer 2uL
，正向引物
(F
，
10uM)1uL
，反向引物
(R
，
10uM)1uL
，探针
(P
，
5uM)1uL
，
H20 13uL
，
DNA
模板
2uL
，混合均匀；步骤3：微滴制备，使用
PCR
系统中的全自动上样仪将
20ul PCR
反应液均匀分散至芯片中...

【专利技术属性】
技术研发人员：王一雪，张彩艳，陆国平，陈伟明，闫钢风，刘静，
申请(专利权)人：复旦大学附属儿科医院，
类型：发明
国别省市：