重组半乳糖凝集素－１二串体蛋白及其制备方法技术

本发明专利技术公开了重组半乳糖凝集素－１二串体蛋白及其制备方法，具体通过生物技术方法提供具有生物活性的重组Ｇａｌｅｃｔｉｎ－１蛋白，通过构建原核表达载体ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－Ｇａｌ－１、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）－Ｇａｌ－１②，分别转染ＢＬ２１构建工程菌，然后通过ＩＰＴＧ诱导表达，裂菌后的层析分离纯化得到具有生物活性的重组Ｇａｌｅｃｔｉｎ－１单体蛋白或者重组Ｇａｌｅｃｔｉｎ－１二串体蛋白。通过红细胞凝集试验证实了这两种重组Ｇａｌｅｃｔｉｎ－１蛋白均具有明显的生物活性，而且重组Ｇａｌｅｃｔｉｎ－１二串体蛋白的生物活性要高于重组Ｇａｌｅｃｔｉｎ－１单体蛋白。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及目的蛋白质的重组质粒的构建、原核表达、纯化及 鉴定，特别涉及重组半乳糖凝集素-1 二串体蛋白及其制备方法。
技术介绍
1、Galectin-I 的基本特性半乳糖凝集素-1 (Galectin-I)属于内源凝集素的半乳糖凝集素(Galectins)家 族。迄今为止，已发现14个Galectins家族成员，人体至少存在12种，该家族成员均具有结 构上包含约130个氨基酸的糖类识别区(Carbohydrate-recognition domains, CRD)和对 β-半乳糖苷有特殊亲和力两种特性。根据其分子结构的不同可将Galectins划分为三类 @原型，含有单一的糖类识别结构域0 ，包括6￡116(^^1-1、2、5、7、10、13、14 ；②嵌合型，包 含一个糖类识别结构域CRD和一个胶原蛋白样重复结构域，Galectin-3是其唯一成员；③ 串联重复型，两个CRD串联融合，包括Galectin-4、6、8、9、12。Galectin-I由位于22ql2 (第22号染色体长臂1区2带)的LSGALS1基因编码；该 基因转录本由4个外显子剪接而成，长0. 6kb，编码135个氨基酸，其分子量约为14. 5kDa。 Galectin-I是典型的胞浆蛋白，但在细胞表面、细胞外基质、胞浆和核内均有表达，通常以 单体及非共价键形成的同源二聚体形式存在。Galectin-I表达于多种类型的细胞，如胸腺 上皮胞、树突状细胞、内皮细胞、巨噬细胞、骨髓基质细胞和纤维母细胞等，在胸腺、肾脏、骨 骼肌、平滑肌、心肌、感觉和运动神经元及胎盘中含量丰富。2、Galectin-I的生物学功能2. IGalectin-I在免疫系统中的作用研究表明Galectin-I可以通过固有免疫和获得性免疫应答来调节机体自身稳 态。在胸腺选择时，胸腺上皮细胞、巨噬细胞表达的Galectin-I能诱导未成熟的双阳性胸 腺细胞发生凋亡，揭示Galectin-I可能是胸腺选择中的凋亡介导者之一。Galectin-I也可 调节外周活化的T细胞，诱导其凋亡。Rabinovich和同事证明Galectin-I与T细胞表面的 三种分子即⑶45、⑶43和⑶7特异性结合，其中⑶7已被证明是必不可少的，激活AP-I活 性并下调Bcl-2的表达，这很可能Galectin-I诱导凋亡的分子机制。而Galectin-I激发 线粒体途径的凋亡程序也被发现，Ion及其同事证明Galectin-I通过激起酸性神经磷脂酶 调节神经胺酸的释放，降低Bcl-2蛋白的产量，激活Caspas-9和Caspase-3诱导的细胞凋 亡。Galectin-I不仅可以抑制T细胞发挥功效，在体内还有抗炎作用。在自身免疫性 疾病中，Galectin-I通过抑制TNF-α、IFN- y , IL-12等炎症因子的产生，选择性去除自身 反应性T细胞，从而抑制炎症的发生，已成功用于小鼠自身免疫性脑脊髓炎、小鼠类风湿性 关节炎、ConA诱导的急性肝炎、糖尿病等自身免疫性动物模型的预防和治疗。此外，Galectin-I还可抑制微生物感染。细菌脂多糖(LPS)可刺激巨噬细胞、中 性粒细胞脱颗粒，而Galectin-I可抑制LPS释放花生四烯酸以达到抗菌的目的。低浓度的Galectin-I可以完全阻断克氏锥虫感染的鼠巨噬细胞产生L-12，高浓度的Galectin-I可 以触发克氏锥虫感染的巨噬细胞发生凋亡。但Galectin-I可作为HIV-I稳定因子使其稳 定粘附到宿主细胞表面。2. 2Galectin-l在神经系统中的作用Galectin-I主要分布在背根神经节细胞与运动神经元，仅在神经元胞体、 轴突和 成年啮齿动物的雪旺细胞上具有免疫活性。当轴突损伤时，胞浆内Galectin-I减少，大 部分分子从生长的轴突和活化的雪旺细胞中分泌到胞外，并转变成氧化型刺激轴突再生。 McGraw等报道低浓度的氧化型半乳凝素_1即可刺激外周与中枢神经轴索再生。在神经细胞分化方面，Galectin-I能够诱导星形胶质细胞分化，分化的星形胶质 细胞分泌大量的脑源性神经营养因子，对神经元的生长、分化以及突触可塑性的形成起重 要作用。当中风和脑缺血时，给予Galectin-I可增强NMDA受体NRla亚基表达和降低PKC 活性，从而抑制谷氨酸神经毒性，保护中枢神经元免受损伤。在肌萎缩性脊髓侧索硬化 (amyotrophic lateral sclerosis, ALS)患者体内，发现球状体有大量 Galectin-1 聚集， 提示与神经丝的形成有关。将氧化性Galectin-I注射转基因小鼠ALS模型，可起到保护神 经、延长生存期的作用。2. 3Galectin_l在肿瘤发生中的作用Galectin-I在多种肿瘤中均有表达，如星形细胞瘤、黑色素瘤、前列腺癌、甲状 腺癌、结肠癌、膀胱癌和卵巢癌等。多数情况下，Galectin-I的表达与这些肿瘤的侵袭和转 移密切相关。Galectin-I与癌基因H-Ras相互作用，使其锚定于膜上，增强Ras介导的信号 转导过程，从而促进细胞向肿瘤细胞表型转化。Yamaoka等发现抑制Galectin-I在鼠 Glioma细胞系中的表达将会限制肿瘤的生长，表明内源Galectin-I有促进肿瘤生长作用。 Galectin-I还可通过阻断S/G2细胞周期的运行，抑制细胞复制，并诱导细胞发生凋亡。研究显示Galectin-I参与了细胞黏附、侵袭力增强、血管生成和免疫逃逸等 肿瘤转移的多个步骤。Galectin-I可增加前列腺癌和卵巢癌细胞对细胞外基的黏附。 Galectin-I可通过MAC-2BP蛋白调节同型的人黑色素瘤细胞的聚集。在体外，外源性的 Galectin-I可以增强胶质母细胞瘤细胞的运动性。淋巴瘤血管壁中Galectin-I的表达与 其血管密度的增强有很大关系。而在Galectin-I缺陷的小鼠中由于血管新生受到抑制，肿 瘤的生长也受到明显抑制。肿瘤细胞通过分泌Galectin-I抑制活性T细胞功能，进而参与 到肿瘤细胞的免疫逃逸。阻断Galectin-I在肿瘤组织中的抑制作用可激活肿瘤特异性T 细胞应答，使肿瘤组织减小。因此，Galectin-I可考虑作为肿瘤免疫治疗的靶标。
技术实现思路
本专利技术解决的问题在于提供一种重组半乳糖凝集素-1 二串体蛋白及其制备方 法，本专利技术将Galectin-I分别以单串体、二串体的形式在大肠杆菌中高效表达，并且分离 具有生物学活性的Galectin-I重组蛋白，其分离纯化过程简便、廉价、易于扩大化生产。本专利技术是通过以下技术方案来实现的一种重组半乳糖凝集素-1 二串体蛋白，通过甘氨酸和丝氨酸串连两分子的半乳糖凝集素-1，其连接方式为Aalectin-l-Gly-Ser-Galectin-l，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。一种编码所述的重组半乳糖凝集素-1 二串体蛋白的表达载体，包含如SEQID NO. 3所示的核苷酸序列。所述的编码重组半乳糖凝集素-1 二串体蛋白的表达载体，为 pET-22b(+)-Gal-I②表达载体，通过Nde I和Sal I酶切位点将SEQ ID NO. 3所示的核苷 酸序列克隆到本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组半乳糖凝集素－１二串体蛋白，其特征在于，通过甘氨酸和丝氨酸串连两分子的半乳糖凝集素－１，其连接方式为：Ｇａｌｅｃｔｉｎ－１－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇａｌｅｃｔｉｎ－１，其氨基酸序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张英起，李晶，张伟，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]