百香果病毒介导的基因沉默体系的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了百香果病毒介导的基因沉默体系的构建方法及其应用，构建方法是：

【技术实现步骤摘要】
百香果病毒介导的基因沉默体系的构建方法及其应用


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，具体是一种通过病毒介导的百香果基因沉默技术
。

技术介绍

[0002]百香果
(Passiflora edulis Sims)
，学名西番莲，西番莲科，西番莲属，为热带
、
亚热带多年生常绿藤本浆果类果树，因其具有浓郁特殊香气，广受消费者的喜爱
。2021
年宋和张等完成百香果全基因组的测序，为百香果功能基因组学的研究提供了重要参考
。
但是，由于百香果基因组杂合度高，基因组复杂，目前百香果遗传转化体系仍未建立，这极大的限制了百香果基因功能的研究
。
[0003]植物稳定遗传的突变体获得难度大，周期长，效率低
。
基因沉默在生物中普遍存在，表现在抵御病毒
、
转座子等外来核酸的入侵，识别并抑制外源基因表达，维持生物基因组稳定性等
。
病毒诱导的基因沉默
(Virus
‑
induced gene silencing,VIGS)
是一种转录后基因沉默技术，作为一种有效的反向遗传学技术已经广泛应用于植物基因工程的研究中
。
其作用原理是携带目的基因片段的病毒侵染植物后，随着病毒的复制和转录而特异性的诱导序列同源基因
mRNA
降解或被甲基化等修饰，从而引起植物内源基因沉默
、
引起表型或生理指标变化，进而根据表型变异研究目标基因的功能
。
与传统的基因功能研究方法相比，
VIGS
能够在侵染植物当代对目标基因进行沉默和功能分析，无需开发稳定的转化子，并且具有沉默单个或多个基因家族成员的潜力
。
[0004]由于
VIGS
技术操作简单，时间短，其一经建立，即被视为研究植物基因功能的强有力工具，得到了深入的研究和广泛应用，已用于烟草
、
番茄
、
小麦
、
水稻等植物的抗病反应
、
生长发育以及代谢调控的功能基因研究
。
其中由人工改良后的烟草脆裂病毒
(tobacco rattle virus,TRV)
诱导的基因沉默，以其沉默效率高
、
持续时间长
(30
‑
40
天左右
)
，寄主植物病毒症状轻，不会掩盖沉默表型等优点，成为目前应用最为广泛的一类基因沉默体系
。
但是目前，还未曾有以西番莲科
、
西番莲属植株为实验对象，建立病毒诱导基因沉默体系研究的报道
。
[0005]百香果作为热带
、
亚热带多年生常绿植物，其生长周期相对较短，基因组小，有着巨大的科研价值
。
因此，现需研究一种能够快速
、
精准
、
高效的百香果病毒诱导的基因沉默技术
。
而病毒选择
(TRV)、
靶基因片段选择
、
介导转化农杆菌的活性
、
侵染液的配制
、
病毒载体的接种技术
、
接种时期
、
接种后培养植物材料的光温条件等因素都是影响病毒诱导基因沉默体系能否成功建立的关键
。

技术实现思路

[0006]为解决上述技术问题，本专利技术提供百香果病毒介导的基因沉默体系的构建方法及其应用，能够快速高效获得转基因植株，稳定性强，操作简单
。
实现了快速获得基因沉默目的，加快百香果功能基因组学的研究进程
。
[0007]为了实现上述本专利技术的目的，采取如下技术方案：
[0008]百香果病毒介导的基因沉默体系的构建方法，包括以下步骤：
[0009](1)
提取百香果嫩叶的
RNA
，反转录获得
cDNA
；
[0010](2)
选择百香果八氢番茄红素脱氢酶基因
PePDS
为保守干扰片段，如
SEQ ID NO.1
所示；
[0011]SEQ ID NO.1
：
[0012]ATGCCCTTCCACACCAAATTTTCCAAGTGAAGTAATTCTTGCTTCCAAGAAATGATTCTT
[0013]CATGCGAGTGTTCCTGCTTTGAATTTTAGCCGGCAAAGCAATGCCTTGGATGTTCGAAAC
[0014]TGCCTTTCTTCTTCCCTCAGATGCGGTGCTCATCCTTCTTCTTTAAAAATTCAATCTGCAAATCCCCGTAAAGCAAGTCTCAGGAGTGTCT。
[0015](3)
百香果八氢番茄红素脱氢酶基因
PePDS
扩增的特异性引物设计，上游引物：5’‑
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGCCCTTCCACACCAAA
‑3’
，下游引物：5’‑
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGACACTCCTGAGACTTG
‑3’
，并进行
cDNA
片段
PCR
扩增，纯化后获得
PePDS
基因干扰片段；
[0016]PCR
扩增采用
25
μ
L
体系进行扩增，包含：双蒸水
18.5
μ
L
；
cDNA 1
μ
L
；
dNTP 2.5
μ
L
；耐热
Taq
酶1μ
L
；上游引物1μ
L
，下游引物1μ
L。
[0017]所述
PCR
扩增程序为
98℃
预变性
3min
；
34
个循环的
98℃
变性
30s
，
62℃
退火
30s
，
72℃
延伸
30s
；
72℃
后延伸
5min
，
12℃
保存，纯化后备用
。
[0018](4)
将纯化的
PePDS
基因干扰片段通过重组反应同步连接到植物病毒
pTRV2
载体上，构建得到百香果八氢番茄红素脱氢酶基因
PePDS
沉默体系，转化成功后，即
pTRV2
‑
PePDS。
[0019]所述步骤
(4)
包括...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
百香果病毒介导的基因沉默体系的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)
提取百香果嫩叶的
RNA
，反转录获得
cDNA
；
(2)
选择百香果八氢番茄红素脱氢酶基因
PePDS
为保守干扰片段，如
SEQ ID NO.1
所示；
(3)
百香果八氢番茄红素脱氢酶基因
PePDS
扩增的特异性引物设计，上游引物：5’‑
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGCCCTTCCACACCAAA
‑3’
，下游引物：5’‑
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGACACTCCTGAGACTTG
‑3’
，并进行
cDNA
片段
PCR
扩增，纯化后获得
PePDS
基因干扰片段；
(4)
将纯化的
PePDS
基因干扰片段通过重组反应同步连接到植物病毒
pTRV2
载体上，构建得到百香果八氢番茄红素脱氢酶基因
PePDS
沉默体系，为
pTRV1
，
pTRV2
‑
PePDS
，转化成功后，即
TRV
‑
PePDS。2.
根据权利要求1所述的百香果病毒介导的基因沉默体系的构建方法，其特征在于：所述步骤
(3)PCR
扩增采用
25
μ
L
体系进行扩增，包含：双蒸水
18.5
μ
L
；
cDNA1
μ
L
；
dNTP 2.5
μ
L
；耐热
Taq
酶1μ
L
；上游引物1μ
L
，下游引物1μ
L。3.
根据权利要求2所述的百香果病毒介导的基因沉默体系的构建方法，其特征在于：所述
PCR
扩增程序为
98℃
预变性
3min
；
34
个循环的
98℃
变性
30s
，
62℃
退火
30s
，
72℃
延伸
30s
；
72℃
后延伸
5min
，最后
12℃
保存，纯化后备用
。4.
根据权利要求1所述的百香果病毒介导的基因沉默体系的构建方法，其特征在于：所述步骤
(4)
包括
BP
反应和
LR
反应；所述
BP
反应是将纯化后获得
PePDS
基因干扰片段1μ
L
，
pDONR 207
质粒1μ
L
，
Gateway BP Clonase 0.5
μ
L
，
22℃
连接过夜；连接后产物转化大肠杆菌
DH5
α
感受态细胞，涂布于含
100mg/L
硫酸庆大霉素抗生素的
LB
平板培养基，
37℃
倒置过夜培养；挑取单克隆至含有
100mg/L
硫酸庆大霉素抗生素的液体
LB
培养基中，
37℃
，
200
转每分钟震荡培养
12
小时，提取质粒，测序正确后备用；所述
LR
反应是转化后的含有
PePDS
基因片段的
pDONR 207
质粒1μ
L
，
pTRV2
质粒1μ
L
，
Gateway LR Clonase 0.5
μ
L
，置于
22℃
，黑暗连接3‑
5h
；连接产物转化大肠杆菌
DH5
α
感受态细胞，涂布于含
100mg/L
卡纳霉素抗生素的
LB
平板培养基，
37℃
倒置过夜培养，挑取单克隆至含有
1...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦源，王路路，王小媚，柴改凤，郑平，黄东平，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：