人工优化设计的制造技术

本发明专利技术提供了人工优化设计的

【技术实现步骤摘要】
人工优化设计的5`UTR序列提高外源基因的翻译表达


[0001]本专利技术属于生物

。
具体地，涉及
mRNA
合成
，涉及一种具有增强在真核细胞中基因表达水平的
5'UTR
结构序列
。

技术介绍

[0002]在体内表达重组基因可以用于疫苗治疗和基因治疗
。
此前质粒
DNA
和重组病毒已被广泛使用，基于体外转录
(IVT,in vitro transcription)
合成技术的 mRNA
疫苗技术和
mRNA
治疗方法也因制备工艺的进展正加速进入临床试验
。
为了更有效地表达
mRNA
，一个完整的
mRNA
分子应该包括
5'
帽子
、5'UTR (untranslated region
，非翻译区
)、
目的基因编码区
、3'UTR
以及多聚腺苷酸 (polyA)
尾
。
其中，
5'UTR
和
3'UTR
，含有多种顺式作用元件，对维持
mRNA
的稳定性和所编码蛋白质的表达至关重要
。
[0003]优化
5'UTR
结构可以促进其编码蛋白质的高表达
。5'UTR
主要表现两个方面的功能：稳定
mRNA
分子结构以及方便核糖体亚基的亚结构单位扫描
、
识别和定位起始密码子
。
因此，
5'UTR
在提高目的基因的表达量和增加其在细胞内的稳定性方面发挥重要作用
。
[0004]然而，目前的
5'UTR
结构在细胞水平和体内的表达量还不够高，因此在实际应用中需要引入更多的工艺流程去增强其表达量才能达到临床要求，耗时长，工艺繁琐，且增加了成本，效果仍难以令人满意
。
使用目的基因自身的
5'UTR 可能因为不表达目的基因基因全长而只表达其片段而不适合，或者其效率对目的基因经常并不是最优，也可能因为其长度可能太长而影响
mRNA
制备的载量
。
选择高表达人源基因的
5'UTR
结构也因筛选工作巨大，基因种类庞大，生理条件的差异而事倍功半
。
人工从头设计是突破工作量巨大的一种尝试，但要有相应的数据积累和对
5'UTR
结构和性质的理解
。
[0005]因此，本领域迫切需要开发一种人工设计的能增强目的基因表达的
5'UTR 结构，以实现在
mRNA
治疗中更优的应用；也需要建立一种
5'UTR
结构效率评价方法，充分评价和验证
5'UTR
的效果，并以此基础筛选出更佳的
5'UTR
结构
。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的就是提供一种能增强目的基因表达的
5'UTR
结构
。
[0007]在本专利技术的第一方面，提供了一种
5'UTR
元件，所述
5'UTR
元件具有选自下组的序列：如
SEQ ID NO:10
‑
13
所示的核苷酸序列或其衍生序列，
[0008]其中，所述衍生序列是指对上述核苷酸序列中任意一种核苷酸序列任选地经过添加
、
缺失
、
修饰和
/
或取代至少一个
(
如1‑3个
)
核苷酸并能保留增强目的基因的表达能力的衍生序列
。
[0009]在另一优选例中，所述衍生序列包括与上述核苷酸序列中任意一种核苷酸序列的同源性为至少
85
％
、
至少
90
％
、
至少
95
％
、
至少
96
％
、
至少
97
％
、
至少
98
％或至少 99
％的核苷酸序列
。
[0010]在本专利技术的第二方面，提供了一种
DNA
模板，所述
DNA
模板包含如本专利技术第一方面
所述的
5'UTR
元件
。
[0011]在另一优选例中，所述的
DNA
模板具有式
I
结构：
[0012]Z1
‑
Z2
‑
Z3
‑
Z4
‑
Z5
‑
Z6
‑
Z7
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(I)
[0013]式中，
[0014]Z1、Z7
为无或酶切位点；
[0015]Z2
为无或启动子元件；
[0016]Z3
为如本专利技术第一方面所述的
5'UTR
元件；
[0017]Z4
为目的编码序列；
[0018]Z5
为
3'
‑
UTR
元件；
[0019]Z6
为
polyA
尾元件
。
[0020]在另一优选例中，所述酶切位点为限制性内切酶位点
。
[0021]在另一优选例中，所述限制性内切酶选自
type II
型限制性内切酶的一种或多种
。
[0022]在另一优选例中，所述限制性内切酶选自下组的一种或多种：
type IIS
型限制性内切酶
、BamHI、Spe I、Mlu I、Hind III、Bgl II、Bcu I、BshT1、CsiI、Mbo I。
[0023]在另一优选例中，所述
type IIS
型限制性内切酶选自下组：
BspQ I、Bve I、FaqI、Bpi I
等
。
[0024]在另一优选例中，所述限制性内切酶为
BamHI。
[0025]在另一优选例中，所述
Z2
选自下组：
T7
启动子
、SP6
启动子
、T3
启动子，或其组合
。
[0026]在另一优选例中，所述
Z2
为
T7
启动子
。
[0027]在另一优选例中，所述
Z4
为选自下组免疫原的编码序列：肿瘤相关抗原或其抗原表位
、
肿瘤特异性抗原或其抗原表位，或其组合
。
[0028]在另一优选本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
5'UTR
元件，其特征在于，所述
5'UTR
元件具有选自下组的序列：如
SEQ ID NO:10
‑
13
所示的核苷酸序列或其衍生序列，其中，所述衍生序列是指对上述核苷酸序列中任意一种核苷酸序列任选地经过添加
、
缺失
、
修饰和
/
或取代至少一个
(
如1‑3个
)
核苷酸并能保留增强目的基因的表达能力的衍生序列
。2.
一种
DNA
模板，其特征在于，所述
DNA
模板包含如权利要求1所述的
5'UTR
元件
。3.
一种
mRNA
，其特征在于，所述
mRNA
为如权利要求2所述的
DNA
模板的转录本
。4.
一种表达载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求2所述的
DNA
模板或如权利要求3所述的
mRNA。5.
一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求4所述的载体或如权利要求3所述的
mRNA
，或其基因组中整合有如权利要求2所述的
DNA
模板或如权利要求1所述的
5'UTR
元件
。6.
一种构建如权利要求3所述的
mRNA
的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(i)
提供如权利要求1所述的
5'UTR
元件，将所述
5'UTR
元件融合到目的基因编码序列的上游，并构建一含有如权利要求2所述
DNA
模板的载体；
(ii)
将
(i)
中获得的载体酶切线性化获得所述
DNA
模板，并进行转录，从而获得所述
mRNA
；和
(iii)
任选地，对步骤
(ii)
中获得的所述
mRNA
进行纯化和
/
或修饰
。7.
一种产生如权利要求3所述的
mRNA
的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(a)
在适合的条件下，培养如权利要求5所述的宿主细胞，从而获得一载体的培养物，其中所述载体含有如...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘钰山，陈国友，
申请(专利权)人：上海惠盾生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：