一种肺癌肿瘤浸润淋巴细胞亚群的检测方法技术

本发明专利技术公开一种肺癌肿瘤浸润淋巴细胞亚群的检测方法，包括如下步骤：

【技术实现步骤摘要】
一种肺癌肿瘤浸润淋巴细胞亚群的检测方法


[0001]本专利技术涉及细胞检测

。
具体地说是一种肺癌肿瘤浸润淋巴细胞亚群的检测方法
。

技术介绍

[0002]流式细胞术
(Flow Cytometry
，
FCM)
是一种对单个细胞表面或细胞内化学成分的不同，对不同类型细胞进行荧光定量分析的新技术
。
其工作原理是对单个细胞或分子进行荧光标记后，通过识别细胞表面特异的免疫荧光信号，进行多参数的定量分析，其主要通过采集前向散射光
(FSC)
将体积大小不同的细胞分开，并采集侧向散射光
(SSC)
将胞内粒度不同的细胞分开，进而通过识别细胞表面和细胞内特异的荧光标记，实现对
DNA、RNA、
细胞因子
、
细胞表面抗原等的检测，有助于评价机体的细胞免疫功能
。
[0003]肺癌肿瘤浸润淋巴细胞各亚群在肿瘤免疫微环境中扮演各自重要的角色，多色流式细胞术的发展使得能检测的标记数量越来越多，流式细胞术也因此广泛应用于科研工作与临床实践中
。
但由于多色流式细胞术普遍存在荧光补偿问题，流式常规临床检测中，需要同时标记几管细胞才能完成
20
种左右抗体的检测
。
为了便于分析不同管中某种细胞的表型，需要重复使用较多的设门抗体，使得检测的抗体总数较多，成本较高，如果控制成本，减少重复设门抗体数目，则难以精确分析不同管中细胞所检测抗体之间的关系，此外，由于需要几管抗体组合才能完成检测，而每管选择的抗体种类
、
克隆号及荧光素均不同，这些均会严重影响抗体检测的结果
。

技术实现思路

[0004]为此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种肺癌肿瘤浸润淋巴细胞亚群的检测方法，能够在仅使用一管样本的条件下检测肿瘤免疫微环境中数十种免疫细胞亚型，验证肿瘤免疫微环境中的浸润淋巴细胞分析来源及功能状态，较全面的解析肿瘤免疫微环境，节省了样本用量，也避免了多管检测引起的设门抗体浪费和难以评估抗体建关系的难题
。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：
[0006]一种肺癌肿瘤浸润淋巴细胞亚群的检测方法，包括如下步骤：
[0007]S1、
制备单细胞悬液，将包含浸润边缘的肺癌肿瘤组织标本经单细胞组织解离后获得单细胞悬液；
[0008]S2、
活死细胞染色，向单细胞悬液中加入活死细胞染料，混匀后避光染色，再经
PBS
清洗
、
离心
、
重悬后加入人
‑
AB
血清进行抗体封闭；
[0009]S3、
抗体染色孵育，根据
TILs
鉴定方案，取封闭后的单细胞悬液一份，加入
PD
‑1单抗，混匀后避光染色，经
PBS
清洗
、
离心
、
重悬后，使用流式细胞仪上机检测；
[0010]S4、
分析检测结果，使用
FlowJo
软件分析数据，获得肺癌肿瘤浸润淋巴细胞各亚群淋巴细胞的比例
。
[0011]更进一步地，
S1
中，单细胞悬液的制备过程如下：
[0012]A1、
肺癌肿瘤组织标本采集完成后完全浸泡于
4℃RPMI+10
％
FBS
溶液内并存放于冰盒内备用；
[0013]A2、
将存放不超过2小时的肺癌肿瘤组织标本用
4℃1X PBS
漂洗，然后用消毒手术刀片反复切碎至组织呈泥状；
[0014]A3、
将切碎的肺癌肿瘤组织标本转移至装有组织消化溶液的
2mL
离心管内充分混匀，并在
37℃
下水浴1小时，待消化完全后用
16
‑
gauge
针头和
40
μ
m
细胞滤网过滤，获得滤液；
[0015]A4、
将滤液经
PBS
清洗后放入
4℃
预冷离心机中，以
500g
离心转速离心
5min
，弃上清液，再加入
100
μ
l PBS
液，重悬细胞沉淀，获得单细胞悬液
。
[0016]更进一步地，所述组织消化溶液采用
complete media+0.225mg/mL collagenase type IV。
[0017]更进一步地，
S2
中，活死细胞染料的用量为
0.5
μ
l
，活死细胞染料采用
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain
；
[0018]单细胞悬液和活死细胞染料混匀后置于冰上避光染色
30min
，用
1ml PBS
清洗，并在
4℃
预冷离心机以
500g
离心转速离心
5min
；
[0019]抗体封闭时，将离心后的单细胞悬液和活死细胞染料混合液用
50
μ
l PBS
重悬并加入1μ
l
人
‑
AB
血清充分混匀，置于冰上避光封闭
10min。
[0020]更进一步地，
S3
中，
PD
‑1单抗加入后充分混匀并置于冰上避光染色
30min
，然后加入
PBS
液清洗，在
4℃
预冷离心机以
500g
离心转速离心
5min
，再用
PBS
重悬，在无菌条件下用
40
μ
m
细胞筛过滤，将其置于流式上机管中
。
[0021]更进一步地，
S3
中，使用流式细胞仪上机检测时，包括：
[0022]a、
确定电压和补偿：按照光谱流式细胞仪的既定操作设定电压，根据染色方案的荧光配色制备单染样本，用于仪器设定；
[0023]b、
仪器设置
、
校正和质控：开机预热机器
20min
并冲洗，检测内质控品，使各检测值在控制范围内，调取
AL
‑
PANAL
上样，采集数据；
[0024]c、
上机检测：按照预设的仪器条件，单个流式上机管获取5‑
10
万细胞
。
[0025]更进一步地，使用流式细胞仪上机检测时，利用
FSC/SSC
去除碎片
、
黏连细胞及本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种肺癌肿瘤浸润淋巴细胞亚群的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、
制备单细胞悬液，将包含浸润边缘的肺癌肿瘤组织标本经单细胞组织解离后获得单细胞悬液；
S2、
活死细胞染色，向单细胞悬液中加入活死细胞染料，混匀后避光染色，再经
PBS
清洗
、
离心
、
重悬后加入人
‑
AB
血清进行抗体封闭；
S3、
抗体染色孵育，根据
TILs
鉴定方案，取封闭后的单细胞悬液一份，加入
PD
‑1单抗，混匀后避光染色，经
PBS
清洗
、
离心
、
重悬后，使用流式细胞仪上机检测；
S4、
分析检测结果，使用
FlowJo
软件分析数据，获得肺癌肿瘤浸润淋巴细胞各亚群淋巴细胞的比例
。2.
根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
S1
中，单细胞悬液的制备过程如下：
A1、
肺癌肿瘤组织标本采集完成后完全浸泡于
4℃RPMI+10
％
FBS
溶液内并存放于冰盒内备用；
A2、
将存放不超过2小时的肺癌肿瘤组织标本用
4℃1X PBS
漂洗，然后用消毒手术刀片反复切碎至组织呈泥状；
A3、
将切碎的肺癌肿瘤组织标本转移至装有组织消化溶液的
2mL
离心管内充分混匀，并在
37℃
下水浴1小时，待消化完全后用
16
‑
gauge
针头和
40
μ
m
细胞滤网过滤，获得滤液；
A4、
将滤液经
PBS
清洗后放入
4℃
预冷离心机中，以
500g
离心转速离心
5min
，弃上清液，再加入
100
μ
lPBS
液，重悬细胞沉淀，获得单细胞悬液
。3.
根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述组织消化溶液采用
complete media+0.225mg/mL collagenase type IV。4.
根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
S2
中，活死细胞染料的用量为
0.5
μ
l
，活死细胞染料采用
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain
；单细胞悬液和活死细胞染料混匀后置于冰上避光染色
30min
，用
1ml PBS
清洗，并在
4℃
预冷离心机以
500g
离心转速离心
5min
；抗体封闭时，将离心后的单细胞悬液和活死细胞染料混合液用
50
μ
lPBS
重悬并加入1μ
l
人
‑
AB
血清充分混匀，置于冰上避光封闭
10min。5.
根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
S3
中，
PD
‑1单抗加入后充分混匀并置于冰上避光染色
30min
，然后加入
PBS
液清洗，在
4℃
预冷离心机以
500g
离心转速离心
5min
，再用
PBS
重悬，在无菌条件下用
40
μ
m
细胞筛过滤，将其置于流式上机管中
。6.
根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
S3
中，使用流式细胞仪上机检测时，包括：
...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗宏，蔡绪雨，代思思，郭婷婷，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：