本发明专利技术涉及一种ＤＮＡ适体修饰的新型生物电化学传感器及其制备方法。该新型生物电化学传感器，为三电极体系传感器，其特征在于所述的三电极中的对电极是铂电极，参比电极是饱和甘汞电极，工作电极为金电极，在该金电极上修饰有ＤＮＡ适体链。本发明专利技术的ＤＮＡ适体修饰的新型生物电化学传感器结合了ＤＮＡ适体高特异性以及电化学检测方法高灵敏度的特点，使癌细胞的早期诊断成为可能。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种新型生物电化学传感器及其制备方法，特别是一种DNA适体修饰的新型生物电化学传感器及其制备方法。
技术介绍
癌症，是当今社会中存在的严重威胁人类身体健康的疾病之一。其中，急性淋巴细 胞白血病对于孩子们身体健康的威胁尤其明显。据文献报道，在患急性淋巴细胞白血病病 人中有接近三分之二是儿童。并且，在现有的治疗手段中，低治愈率以及高复发率也是癌症 治疗过程中存在的问题。然而，若在癌症早期即能被诊断出来的话，则将大大提高病人的存 活率，并且也有研究证明，早期诊断和及时治疗是提高病人存活率的有效方法之一。因此， 针对癌症的分子水平特征，进行癌症早期诊断的研究就显得极为重要。电化学生物传感器是一类以电极作为信号转换器，以电位或电流加以测量的生物 传感器。电化学体系借助电极实现电能的输入或输出，从而获得电极表面修饰物质的电信 号，常用的为三电极体系。三电极体系包括工作电极、辅助电极(也称对电极)和参比电极， 电流流经工作电极和对电极。工作电极所测得的电位是相对于参比电极而言。电化学作为 一种分析检测方法，具有设备低廉、灵敏度高、简便快捷等优点。具体包括以下几种方法1.循环伏安法是最常用的一种方法，它在解释电子传递机理方面有独特的优势；2.示差脉冲法则拥有更高的灵敏度，因此常用作检测；交流阻抗法在表面表征方 面具有独特的优势，因而常用来辅助表征电极的表面状态。3.在表面表征方面，显微镜技术具有直观可靠的优点。近来，研究人员报道了一种称作适体的分子探针。适体为单链DNA、RNA或是经 过修饰的核酸，是通过一种体外选择过程SELEX(指数富集的配体系统进化)产生的。在 SELEX技术中，能从大量的单链随机寡核苷酸文库中筛选出能与靶物质高特异性、高亲和力 结合的核酸配基，即为适体。在已经报道的文献中，适体可以结合小分子物质诸如三磷酸腺 苷(ATP)，或是大分子物质如蛋白质，甚至可以与细胞特异性结合。由于具有高特异性识别 靶物质、低分子量、合成简便、易于修饰、低毒性、高稳定性等特点，适体越来越多被应用于 各项研究以及生物传感器的设计。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种DNA适体修饰的新型生物电化学传感器。用以癌 细胞的早期诊断。本专利技术的目的之二在于提供该传感器的制备方法。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案一种DNA适体修饰的新型生物电化学传感器，为三电极体系传感器，其特征在于 所述的三电极中的对电极是钼电极，参比电极是饱和甘汞电极，工作电极为金电极，在该金 电极上修饰有DNA适体链。上述的DNA适体链为带有巯基的CCRF-CEM急性白血病细胞的DNA适体链。上述的带有巯基的CCRF-CEM急性白血病细胞的DNA适体链为 5， -HS-(CH2)6-ATCTA ACTGCTGCGC CGCCG GGAAA ATACT GTACG GTTAG A-3，。一种制备上述的DNA适体修饰的新型生物电化学传感器的方法，其特征在于该方 法的具体步骤为将处理过的金电极置于IM H2SO4中，在0-1. 5V电压范围内进行循环伏安 扫峰，扫速设置为lOOmv/s，至达到稳定；然后在氮气中吹干该金电极后，将该金电极置于 含有巯基DNA适体链的溶液的Eppendorf管中，该溶液含有浓度为0. 05pM 50pM的HS-DNA 适体，IOmM Tris-HCl, ImM EDTA, IM NaCl 和 0. 5 μ M 的 pH 为 8. O 的 TCEP，倒置 16 小时，再 浸入ImM MCH水溶液中2小时，用超纯水冲洗，并用氮气吹干，即得到DNA适体修饰的金电 极，该金电极与钼电极和饱和甘汞电极一起组成三电极体系的生物电化学传感器；所述的 HS-DNA适体为5，-HS-(CH2)6-ATCTA ACTGC TGCGC CGCCG GGAAA ATACT GTACGGTTAG A-3，。本专利技术第一次在金电极表面修饰上带有巯基的CCRF-CEM急性白血病细胞的DNA 适体链，用于特异性识别和检测靶细胞，在检测过程中，K3 /K4 作为具有 电活性的探针，来表征信号。当样品中存在靶细胞的时候，适体链与靶细胞特异结合，使电 极表面与K3/K4之间的电子传递受到阻碍，因此检测到的电信号较低； 而当样品中没有靶细胞或是存在其他参照细胞(如HL-60原髓白血病细胞)的时候，适体 链不会与其特异性结合，因MK3/K4的电信号较高。这一检测体系结 合了 DNA适体高特异性以及电化学检测方法高灵敏度的特点，使癌细胞的早期诊断成为可 能。附图说明图1 为在 IOmM Tris-HCl, 5mM K3/K4 (pH 7. 0)的缓冲液中，修 饰了不同浓度的DNA适体的金电极的循环伏安图。图2 为在 IOmM Tris-HCl, 5mM K3/K4 (pH 7.0)的缓冲液中， CCRF-CEM细胞(细胞数量250，000)与DNA适体不同反应时间的示差脉冲图。图3 为在 IOmM Tris-HCl, 5mM K3/K4 (pH 7.0)的缓冲液中， HL-60细胞(细胞数量250，000)与DNA适体不同反应时间的示差脉冲图。图4 为在 IOmM Tris-HCl, 5mM K3/K4 (pH 7.0)的缓冲液中， CCRF-CEM细胞(细胞数量250，000)与DNA适体不同反应时间的交流阻抗图。图5 为在 IOmM Tris-HCl, 5mM K3/K4 (pH 7.0)的缓冲液中， HL-60细胞(细胞数量250，000)与DNA适体不同反应时间的交流阻抗图。图6为CCRF-CEM细胞(a)与HL-60细胞(b)在修饰了 DNA适体的镀金云母片上 的显微镜图。具体实施例方式实施例一金电极的修饰在进行适体修饰之前，先在细砂纸上打磨金电极，然后再在Al2O3粉末上打磨，之 后分别在无水乙醇以及超纯水中超声5分钟。为了更好地除去残留在金电极表面的杂质， 将电极置于IM H2SO4中，在0-1. 5V电压范围内进行循环伏安(CV)扫峰，扫速设置为IOOmv/ s，约20圈达到稳定。然后在氮气中吹干电极，进行适体修饰。将金电极分别置于含有巯基DNA 适体链(5，-HS-(CH2)6-ATCTA ACTGC TGCGC CGCCG GGAAA ATACT GTACG GTTAG A-3，) 的Eppendorf管中，其中含有浓度范围为0. 05pM、0. 5pM、5pM以及50pM的HS-DNA适体， IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，IM NaCl 禾口 0. 5 μ M TCEP (ρΗ 8.0)，倒置 16 小时。之后，再浸入 ImM MCH水溶液中2小时。电极修饰完毕后，用超纯水冲洗，并用氮气吹干，得到编号分别为 Α、B、C、D的经修饰的金电极。实施例二 细胞的培养及处理CCRF-CEM细胞(人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞)和HL-60细胞(人原髓细胞 白血病细胞)都购于中科院上海细胞所。这两种细胞均在37摄氏度，5% CO2的培养箱中 培养，培养基为含有10%胎牛血清的1640培养基，在细胞长至对数生长期末端时收集，进 行细胞检测研究。检测前用血球计数板计数，每次使用细胞浓度一般在IO5左右。实施例三修饰到本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种ＤＮＡ适体修饰的新型生物电化学传感器，为三电极体系传感器，其特征在于所述的三电极中的对电极是铂电极，参比电极是饱和甘汞电极，工作电极为金电极，在该金电极上修饰有ＤＮＡ适体链。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李根喜，陈桂芳，刘月星，李婷，陈震宇，陈琳，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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