一种降解抗生素的三角褐指藻突变株及其构建方法与应用技术

本发明专利技术涉及微生物技术领域，公开了一种降解抗生素的三角褐指藻突变株及其构建方法与应用

【技术实现步骤摘要】
周获得三角褐指藻突变株
。
[0015]优选的，所述获取编码三角褐指藻
PtUGGT
基因片段的方法是以三角褐指藻为模板，以如
SEQ ID NO.2
和
SEQ ID NO.3
所示的引物进行
PCR
扩增
。
[0016]优选的，所述质粒骨架中含有荧光标记，所述荧光标记选自
eGFP、mRFP、mCherry
中任意一种
。
[0017]进一步优选的，所述荧光标记选自
eGFP。
[0018]优选的，所述
eGFP
的基因片段以如
SEQ ID NO.4
和
SEQ ID NO.5
所示的引物进行
PCR
扩增
。
[0019]优选的，所述博来霉素的体积比为
0.050
‑
0.090
％
。
[0020]进一步优选的，所述博来霉素的体积比为
0.075
％
。
[0021]优选的，所述感受态细胞为大肠杆菌
DH5
α
感受态细胞
。
[0022]第三方面提供一种降解抗生素的三角褐指藻突变株在处理四环素污水中的应用
。
[0023]相对于现有技术，本专利技术的有益效果如下：
[0024]本专利技术构建的工程藻株，在第
48
小时可降解水体中
90
％的四环素，能够有效
、
低成本
、
环保地去除污染水体中的抗生素
。
附图说明
[0025]图1为
PtUGGT
重组质粒分子示意图；
[0026]图2为本专利技术实施例1与对比例1各藻株对水体中四环素的去除率结果分析图
。
具体实施方式
[0027]为了让本领域技术人员更加清楚明白本专利技术所述技术方案，现列举以下实施例进行说明
。
需要指出的是，以下实施例对本专利技术要求的保护范围不构成限制作用
。
[0028]以下实施例中所用的原料
、
试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到
。
[0029]实施例1[0030]一种降解抗生素的三角褐指藻突变株及其构建方法
。
[0031]在以下具体实施方式中，以野生型三角褐指藻藻株作为出发株来说明一种降解抗生素的三角褐指藻突变株的构建方法
。
[0032]构建方法：
[0033](1)
使用
TIAN GEN
公司的植物基因组
DNA
提取试剂盒提取野生型三角褐指藻基因组
DNA
，使用
Nanodrop
超微量分光光度计测定提取样品浓度；
[0034](2)
以野生型三角褐指藻基因组
DNA
为模板，以如
(PtUGGT
‑
F)SEQ ID NO.2
和
(PtUGGT
‑
R)SEQ ID NO.3
所示的引物进行
PCR
扩增，获取
PtUGGT
基因片段；以
eGFP
质粒为模板，以如
(eGFP
‑
F)SEQ ID NO.4
和
(eGFP
‑
R)SEQ ID NO.5
所示的引物进行
PCR
扩增，得到
eGFP
基因片段
(
表
1)
；
[0035]表1各引物序列
[0036]引物名称引物序列
(5
’‑3’
)PtUGGT
‑
Fcacttgtgcgaacggaattcatgcggttgtggaaacgtacga
PtUGGT
‑
RgcccttgctcaccattcttttcggtgacggaatgtcgeGFP
‑
FccgtcaccgaaaagaatggtgagcaagggcgaggagceGFP
‑
Rcttaaagtaaattgaagcttttacttgtacagctcgtccatgccgagagtg
[0037](3)
使用
EcoRI、HindIII
对空载质粒进行酶切
(
表2为酶切体系
)
；
[0038]表2酶切体系
[0039][0040][0041](4)
使用浓度为
1.5
％的琼脂凝，通过电泳检测
PCR
产物，选择目的条带进行切胶回收；
[0042](5)
通过
TIANGEN EasyGeno
快速重组克隆试剂盒连接线性化空载体，目的基因片段与
eGFP
片段构建重组质粒，反应体系为
(
表
3)
；
[0043]表3反应体系
[0044]成分用量线性化
pPha
‑
NR3ulPtUGGT
基因
1.5uleGFP
基因
0.5ul2xEasyGeno Assembly Mix5ulTotal10ul
[0045](6)
将重组质粒
(
如图
1)
转入感受态大肠杆菌
DH5
α
；
[0046](7)
于平板上挑选5个菌落
,
接种
1mL
含
Amp
抗生素
LB
液体培养基中，置于生化培养箱中，
37℃
，培养至菌液浑浊要转移到
5mL Amp
抗生素
LB
液体培养基过夜培养
。
取
4mL
的菌液，利用
TIANGEN
质粒小提试剂盒进行质粒提取，送测；
[0047](8)
将测序正确的大肠杆菌接种到
150mL
含
Amp
抗生素
LB
液体培养基中，培养过夜，利用质粒大提试剂盒进行质粒大提，低温保存；
[0048](9)
通过基因枪将构建好的重组质粒转化进入三角褐指藻中，将藻细胞至于
f/2
培养基
(
配方如表5所示
)
中过夜培养；次日，将藻细胞转移至含有体积比为
0.075
％博来霉素的抗性
f/2
培养基中，培养3‑4周等待转化子长出；
[0049]表
5f/2
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种降解抗生素的三角褐指藻突变株，其特征在于，所述三角褐指藻突变株为过表达三角褐指藻出发株中
PtUGGT
基因后得到的突变株；所述
PtUGGT
基因的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示
。2.
根据权利要求1所述的三角褐指藻突变株，其特征在于，所述三角褐指藻出发株为
PtUGGT
可正常表达的三角褐指藻
。3.
根据权利要求1所述的三角褐指藻突变株，其特征在于，所述三角褐指藻出发株为野生型三角褐指藻藻株
、
三角褐指藻突变株
、
三角褐指藻转基因工程藻株中任意一种
。4.
权利要求1‑3中任一项所述的三角褐指藻突变株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：构建过表达质粒：获取编码三角褐指藻
PtUGGT
基因片段和质粒骨架，通过重组克隆试剂连接；转化验证：将构建所得的过表达质粒转化入感受态细胞，扩大培养后检测验证构建的过表达质粒的重组序列正确性；构建突变株：将验证正确的过表达质粒转化入三角褐指藻中，将三角褐指藻置于
f/2
培养基中培养6‑
24h
，再将三角褐指藻转移至含有博来霉素的抗性
f/2
培养基中培养3‑4周获得三角褐指藻...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓娟，杜华，王树启，王振，叶智涛，黄微，
申请(专利权)人：汕头大学，
类型：发明
国别省市：