一种干细胞活性因子和外泌体复合雾化吸入溶液的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种干细胞活性因子和外泌体复合雾化吸入溶液的制备方法，包括干细胞分离

【技术实现步骤摘要】
一种干细胞活性因子和外泌体复合雾化吸入溶液的制备方法


[0001]本专利技术涉及细胞生物
，具体涉及干细胞活性因子和外泌体复合雾化吸入溶液的制备方法
。

技术介绍

[0002]间充质干细胞
(Mesenchymal stem cells, MSCs)
是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，在特定的环境中可以定向分化，从而达到修复组织和细胞损伤的作用
。
近年来研究发现，间充质干细胞具有促进组织修复和抗炎作用，其大部分功能是旁分泌作用，通过分泌的可溶性因子或囊泡与靶细胞发生相互作用而产生的
。
在干细胞培养过程中可以向培养基中分泌包含有多种活性因子和外泌体的活性物质
。
[0003]干细胞活性因子：由干细胞合成
、
分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，是上清液中富含细胞生物活性的关键物质
。
包括干细胞因子
、
内皮细胞生长因子
、
表皮细胞生长因子
、
肿瘤坏死因子
、
肝细胞生长因子
、
神经生长因子
、
纤维母细胞生长因子
、
胰岛素样成长因子
、
粒细胞集落刺激因子
、
白细胞介素等几百种
。
干细胞所分泌的活性因子不仅是维持生命活动所需要的，而且在修复机体组织损伤中都是必不可少的
。
[0004]干细胞外泌体
(Exosomes)
：是一种直径在
30
‑
150nm
的双层囊泡结构，被脂质双分子层包裹，外泌体中含有与抗炎或组织损伤修复相关的生物活性因子
。
外泌体是一种运载丰富货物的载体，其功能主要是通过不断转运微小核糖核酸
(miRNAs)
和蛋白来发挥的
。
在
MSCs
来源的外泌体中，已经鉴定出
150
多个 miRNAs
和
850
多个独特的蛋白质，通过不同的途径，改变靶细胞的各种活性
。
大量研究表明干细胞外泌体在诸多疾病的治疗中发挥重要作用，在预防和治疗呼吸道炎症性疾病中同样具有巨大的应用潜力
。
干细胞外泌体是干细胞与靶细胞之间进行信号交流的重要信息载体
。
一旦被分泌到细胞外空间，干细胞囊泡就可以通过与靶细胞的相互作用而被吞入靶细胞，并最终影响靶细胞的表型，从而发挥其特有的生物学功能
。
[0005]单一细胞因子所起的是单一刺激作用，譬如生长因子，作用过强和过于持久时，会引起组织过度生长
。
由于干细胞上清液里因子种类丰富，既有强化的，也有抑制的，所以干细胞上清液是平衡调节细胞生长活化的
。
另外干细胞外泌体除了自有的调节功能外，它的囊泡运输机制可以顺利穿越人体组织屏障，打开细胞信号通道，调控细胞的功能，使细胞因子等能更好地作用于细胞
。
干细胞活性因子和干细胞外泌体可以携带多种生物信息分子，所以共同使用具有多重治疗效应，提高治疗效果
。
[0006]目前，干细胞因子及外泌体产品都是单一的细胞因子或外泌体制剂，还没有两种复合制剂
。
而且传统提取方式还存在干细胞活性因子或外泌体提取效率不高
、
纯度较低，提取过程中损伤外泌体自身结构，影响治疗效果等弊端
。

技术实现思路

[0007]本专利技术提供一种干细胞活性因子和外泌体复合雾化吸入溶液制备方法
。
为了实现
上述目的，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术提供一种含有干细胞活性因子和外泌体复合雾化吸入溶液的制备方法，其包括：在无血清干细胞培养基中传代培养间充质干细胞，在干细胞分裂最旺盛的时期，待细胞融合度达到
80
‑
90
％后，弃去正常培养基，用
PBS
缓冲液清洗3次，然后加入生理盐水，在细胞培养箱中培养
24
小时，收集上清液离心
、
细胞筛网过滤，去除细胞碎片，然后通过
0.22
μ
m
无菌过滤膜过滤除菌后即可得到富含干细胞活性因子
、
外泌体体系的复合溶液
。
[0008]本专利技术的一个实施例中，所述传代培养间充质干细胞传至
P3
代，培养条件为5％二氧化碳
、
温度为
37℃、
湿度为
95
％环境中恒温培养
。
[0009]本专利技术的一个实施例中，所述脐带间充质干细胞是将健康人脐带剔除羊膜
、
动静脉血管后，剪成组织匀浆块，平铺在培养皿里，并加入无血清培养基培养
。
按时更换新鲜培养基培养后，用胰酶消化后，在细胞培养瓶中传代培养，得到所述脐带间充质干细胞
。
[0010]本专利技术的一个实施例中，所述无血清干细胞培养基为
α
‑
MEM
培养基加入
10
％的人源性血清替代物
。
[0011]本专利技术的一个实施例中，所述组织匀浆块体积为1‑
3mm3。
[0012]本专利技术的一个实施例中，所述离心的环境温度为
4℃。
[0013]本专利技术的一个实施例中，所述离心的转速为
1200
转
。
[0014]本专利技术的一个实施例中，所述离心时间为6分钟
。
[0015]本专利技术的一个实施例中，所述细胞筛网为
100
目
。
[0016]本专利技术的一个实施例中，所述培养皿为
150mm。
[0017]本专利技术的一个实施例中，所述细胞培养瓶为
T175
，过滤盖
。
[0018]本专利技术的一个实施例中，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞
。
[0019]本专利技术的一个实施例中，每约
0.5
×
106个脐带间充质干细胞制备得到
1ml
的干细胞活性因子和外泌体复合雾化溶液
。
[0020]本专利技术中，上述所述的方法制备得到的不含外来培养物及死细胞裂解物的干细胞活性因子和外泌体复合溶液
。
其中干细胞活性因子体系包括：干细胞因子（
SCF)、
内皮细胞生长因子（
VEGF)、
表皮细胞生长因子（
EGF )、
肿瘤坏死因子（
TNF)、
肝细胞生长因子（
HGF )、
神经生长因子（
NGF )、
纤维母细胞生长因子 (FGF )、
胰岛素样成长因子（
IGF )、
粒细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种干细胞活性因子和外泌体复合雾化吸入溶液的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)
分离干细胞：原代间充质干细胞；
2)
干细胞的扩增，用无血清培养方法，包括
α
‑
MEM
培养基，加入
10
％的人源性血清替代物，5％
CO2
，
37℃
条件下培养，定期换液，传代，进而得到所需数量的干细胞；
3)
干细胞活性因子和外泌体体系的获取：在干细胞分裂最旺盛的时期，弃去正常培养基，用
PBS
缓冲液清洗3次，然后加入生理盐水，细胞培养箱中培养
24
小时，收集上清液，即可得到富含干细胞活性因子和外泌体体系的溶液；
4)
浓缩
、
贮存：把所得液体离心后用
100
目细胞筛过滤，去除散落细胞及细胞碎片，再用
0.22
μ
m
滤膜过滤除菌，所得干细胞活性因子和外泌体复合溶液，可于
‑
20℃
长期保存
。2.
如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干细胞活性因子和外泌体体系来源于人体干细胞在体外培养过程中所收集的上清液
。3.
如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干细胞活性因子和外泌体体系为干细胞分泌活性因子及外泌体的复合溶液
。4.
如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述上清液是不含有活细胞和死细胞裂解物及细胞碎片
。5.
如权利要求2所述的方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：田源，王帅，王建成，田新宇，
申请(专利权)人：田源，
类型：发明
国别省市：