环境诱导型启动子制造技术

本发明专利技术涉及基因改造技术，公开了一种环境诱导型启动子

【技术实现步骤摘要】
ID NO.1
所示的核苷酸序列的子序列，其保持启动子活性
。
[0009]优选地，该重组载体还含有目标基因
。
[0010]优选地，所述目标基因为编码目标产物生成途径的关键酶的基因和
/
或编码荧光蛋白的基因
。
[0011]优选地，所述目标产物为有机酸，更优选为延胡索酸
、
苹果酸和柠檬酸中的至少一种
。
[0012]优选地，所述关键酶选自延胡索酸酶
、
琥珀酸脱氢酶
、
苹果酸酶和柠檬酸合酶中的至少一种
。
[0013]优选地，所述延胡索酸酶的编码基因的核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示
。
[0014]优选地，所述重组载体的表达载体为
pEASY
‑
pyrG。
[0015]优选地，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白
。
[0016]优选地，所述编码荧光蛋白的基因的核苷酸序列如
SEQ ID NO.3
所示
。
[0017]本专利技术第三方面提供一种重组菌，该重组菌含有上述的启动子或者上述的重组载体
。
[0018]优选地，该重组菌的出发菌株为产酸菌株，优选为黑曲霉
(Aspergillus niger)
，更优选为黑曲霉
ATCC 1015。
[0019]本专利技术第四方面提供上述的启动子
、
上述的重组载体或者上述的重组菌在表达目标基因或合成目标产物中的应用
。
[0020]优选地，所述目标产物为有机酸，更优选为延胡索酸
、
苹果酸和柠檬酸中的至少一种
。
[0021]优选地，所述目标基因选自延胡索酸酶
、
琥珀酸脱氢酶
、
苹果酸酶和柠檬酸合酶中的至少一种
。
[0022]本专利技术第五方面提供一种生产目标产物的方法，该方法包括以下步骤：将重组菌先进行种子培养，再进行发酵培养；其中，所述重组菌含有环境诱导型启动子和编码目标产物生成途径的关键酶的基因，所述环境诱导型启动子的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示，或者，所述环境诱导型启动子为如
SEQ ID NO.1
所示的核苷酸序列的子序列，其保持启动子活性
。
[0023]通过上述技术方案，本专利技术的有益效果为：
[0024]本专利技术提供的环境诱导型启动子在与目标基因形成重组载体，导入出发菌株形成重组菌后，该启动子可特异性地在重组菌培养的种子期自发关闭目的基因的表达，而在重组菌培养的发酵期强烈开启目的基因的表达；基于该启动子的激活特性，将菌株中目标产物生成途径的关键酶作为目标基因，利用该启动子控制关键酶基因在种子期处于非表达状态，而在发酵期处于丰富表达状态，不仅能够有效促进目标产物的合成
、
提高目标产物的产量，还能够规避传统组成型表达策略造成的生长发育妥协，在工业微生物基因改造方面具有非常广泛的应用潜力
。
附图说明
[0025]图1是实施例2中重组载体
pEASY
‑
pyrG
‑
PmfsA
‑
GFP
的质粒图谱；
[0026]图2是实施例3中重组菌
MS1
‑1和
MS1
‑2的平板培养图；
[0027]图3是实施例3中重组菌
MS1
‑1和
MS1
‑2的
WB
检测结果图；
[0028]图4是实施例5中重组载体
pEASY
‑
pyrG
‑
PmfsA
‑
fumA
‑
GFP
的质粒图谱；
[0029]图5是实施例6中重组菌
MS2
‑1和
MS2
‑2的平板培养图；
[0030]图6是实施例6中重组菌
MS2
‑1和
MS2
‑2的
WB
检测结果图；
[0031]图7是本专利技术中启动子
PmfsA
在种子期和发酵期对绿色荧光蛋白表达的工作模型
。
具体实施方式
[0032]在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值
。
对于数值范围来说，各个范围的端点值之间
、
各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开
。
[0033]本专利技术第一方面提供一种环境诱导型启动子，该环境诱导型启动子的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示，或者，所述环境诱导型启动子为如
SEQ ID NO.1
所示核苷酸序列的子序列，其保持启动子活性
。
[0034]本专利技术中，该环境诱导型启动子的子序列指的是保留启动子活性并包含
SEQ ID NO.1
所示序列中至少
700
个核苷酸，优选为包含
SEQ ID NO.1
所示序列中至少
700
个核苷酸，更优选为包含
SEQ ID NO.1
所示序列中至少
800
个核苷酸，进一步优选为包含
SEQ ID NO.1
所示序列中至少
850
个核苷酸
。
[0035]本专利技术的专利技术人，在针对有机酸生产菌株的研究过程中，意外地发现，环境诱导型启动子
PmfsA
能够在黑曲霉
ATCC 1015
中控制表达编码绿色荧光蛋白
GFP
，使得
GFP
蛋白在发酵前的种子培养阶段不被表达，而在发酵培养阶段被丰量表达；基于此，通过进一步验证，该启动子可特异性地在重组菌培养的种子期自发关闭目的基因的表达，而在重组菌培养的发酵期强烈开启目的基因的表达；基于该启动子的激活特性，将菌株中目标产物生成途径的关键酶作为目标基因，利用该启动子控制关键酶基因在种子期处于非表达状态，而在发酵期处于丰富表达状态，不仅能够有效促进目标产物的合成
、
提高目标产物的产量，还能够规避传统组成型表达策略造成的生长发育妥协，在工业微生物基因改造方面具有非常广泛的应用潜力
。
[0036]本专利技术中，种子期指的是微生物菌株的菌种接种至种子培养基中进行种子培养使菌体长得粗壮
、
成为活力强的种子的阶段，种子培养基的营养成分要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量较高；发酵期指的是将种子期得到的种子接种至发酵培养基进行发酵培养以快速生长
、
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种环境诱导型启动子，其特征在于，该环境诱导型启动子的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示，或者，所述环境诱导型启动子为如
SEQ ID NO.1
所示核苷酸序列的子序列，其保持启动子活性
。2.
一种重组载体，其特征在于，该重组载体含有环境诱导型启动子，所述环境诱导型启动子的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示，或者，所述环境诱导型启动子为如
SEQ ID NO.1
所示的核苷酸序列的子序列，其保持启动子活性
。3.
根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，该重组载体还含有目标基因；优选地，所述目标基因为编码目标产物生成途径的关键酶的基因和
/
或编码荧光蛋白的基因
。4.
根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述目标产物为有机酸，更优选为延胡索酸
、
苹果酸和柠檬酸中的至少一种；优选地，所述关键酶选自延胡索酸酶
、
琥珀酸脱氢酶
、
苹果酸酶和柠檬酸合酶中的至少一种；优选地，所述延胡索酸酶的编码基因的核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示；优选地，所述重组载体的表达载体为
pEASY
‑
pyrG。5.
根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白；优选地，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄和，时曼，张驰，张蕊，徐晴，薛锋，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：