快速鉴定禾谷镰孢菌对制造技术

本发明专利技术公开了禾谷镰孢菌琥珀酸脱氢酶

【技术实现步骤摘要】
快速鉴定禾谷镰孢菌对Cyclobutrifluram抗药性的方法


[0001]本专利技术属于分子生物学

,
涉及一种禾谷镰孢菌琥珀酸脱氢酶
B(FgSdhB)
和
C1(FgSdhC1)
蛋白相关基因
FgSdh B
和
FgSdh C1上核苷酸点突变的鉴定及其在杀菌剂
Cyclobutrifluram
抗性检测中的应用，具体涉及一种快速鉴定禾谷镰孢菌
FgSdh B
和
FgSdh C1基因核苷酸点突变及其对
Cyclobutrifluram
抗药性的分子检测方法及专用引物
。

技术介绍

[0002]近年来，我国黄淮麦区包括河北
、
河南
、
安徽
、
山东
、
江苏及陕西等，由镰孢菌引起的小麦赤霉病和茎基腐病已成为小麦生产上的重大病害，严重威胁小麦产量和质量的同时还具有潜在的真菌毒素污染风险
。
禾谷镰孢菌
(Fusarium graminearum)
是我国北方地区小麦赤霉病的优势种群，同时也是小麦茎基腐病的优势病原菌之一
。
遗憾的是，目前我国尚未有登记的化学药剂用于小麦茎基腐病的防治
。
而生产上防治小麦赤霉病的杀菌剂主要包括苯并咪唑类杀菌剂
、
三唑类杀菌剂
、
甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂和氨基丙烯酸酯类杀菌剂等
。
但随着药剂的长期及不科学合理使用，导致小麦赤霉病菌对多种防治药剂产生了不同程度的抗性，并且一些杀菌剂会刺激镰孢菌毒素的合成
。
如在多菌灵的高选择压力下，小麦赤霉病菌抗多菌灵菌株在群体中的比例不断上升，导致多菌灵对小麦赤霉病的田间防效降低
。
唑类杀菌剂如己唑醇
、
苯醚甲环唑
、
丙环唑和戊唑醇等对小麦赤霉病都具有较好的预防和治疗效果，但低浓度的唑类杀菌剂会刺激禾谷镰孢菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇
(DON)
的合成
。
虽然
QoI
类杀菌剂对禾谷镰孢菌具有较好的活性，但也会促进
DON
毒素的生物合成
。
而由先正达公司研发的新型琥珀酸脱氢酶抑制剂
Cyclobutrifluram
对
F.graminearum
具有优异的抑制活性
。
当前杀菌剂抗性行动委员会
(Fungicide Resistance Raction Committee
，
FRAC)
将其抗药性风险定为中等到高等，需要进行抗性的风险管理
。
本研究室通过药剂驯化的方法得到了对
Cyclobutrifluram
产生高水平抗性的禾谷镰孢菌菌株，并且有一些高水平抗性菌株的生存适合度较高
。
小麦赤霉病属气传病害，其病原菌禾谷镰孢固有抗性风险水平为中到高等，综合推测赤霉病菌禾谷镰孢对
Cyclobutrifluram
具有中到高等抗性风险
。
但是小麦茎基腐病属于土传病害，在该病害的防控过程中
Cyclobutrifluram
常用于种子处理，综合推测小麦茎基腐病原菌禾谷镰孢对
Cyclobutrifluram
有中等抗性风险
。
因此，未来在使用
Cyclobutrifluram
防治植物病原真菌病害时，需要加强抗性监测，并对
Cyclobutrifluram
的抗性发生情况进行及时的预警，从而指导
Cyclobutrifluram
的科学使用，延缓其抗药性的产生，延长药剂的使用年限
。
[0003]杀菌剂抗性常规检测方法包括：菌丝生长速率法
、
菌丝干重测定法
、
孢子萌发测定法和琼脂展布法等
。
但是这些方法都需要先分离并纯化获得病原菌，然后将病原菌接种到带药培养基上或者接种于杀菌剂处理过的活体植株或组织上，一定时间之后才能调查结果
。
采用常规的方法，当田间抗药性菌株的频率大于1％时，才能被检测的到
(
如有
95
％的概率检测到1％频率的抗药性菌株，检测的样本量需要大于
300)
，因此具有灵敏度低，工作量大，试验周期长等缺点
。
[0004]随着分子生物学技术的飞速发展及其应用范围的不断扩展，限制性酶切
PCR
和等位特异
PCR
分子技术开始在病原菌抗药性检测中应用
。
与传统的检测方法比较，不但节省了检测时间提高了工作效率，而且增强了检测的灵敏度，检测频率在
10
‑5～
10
‑4，更适用于检测低频率的抗药性基因，也被作为田间抗药性早期诊断的理想方法
。
因此，分子检测技术将在病害的可持续管理系统中发挥愈来愈重要的作用
。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种禾谷镰孢菌对
Cyclobutrifluram
抗性相关蛋白及其编码基因，以及其作为禾谷镰孢菌对
Cyclobutrifluram
抗性筛选标记，在进行禾谷镰孢菌对
Cyclobutrifluram
抗性鉴定中的应用
。
[0006]为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：
[0007]本专利技术的一个目的是提供禾谷镰孢菌
Cyclobutrifluram
抗性相关蛋白，是如下
1)
或
2)
所示的蛋白质：
[0008]1)
由序列表中的
SEQ ID NO:15/SEQ ID NO:16
的氨基酸残基序列组成的蛋白质；
[0009]2)
将序列表中的
SEQ ID NO:15/SEQ ID NO:16
的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和
/
或缺失和
/
或添加且与
Cyclobutrifluram
抗性功能相关的由
SEQ ID NO:15/SEQ ID NO:16
衍生的蛋白质
。
[0010]SEQ ID NO:15
如下所示：
[0011][0012]SEQ ID NO:15
中，自氨基端第
248
位氨基酸
X
为
H
或
Y。
[0013]SEQ ID NO:16
如下所示：
[0014][0015本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
禾谷镰孢菌对
Cyclobutrifluram
抗性相关蛋白，是如下
1)
或
2)
所示的蛋白质：
1)
由序列表中的
SEQ ID NO:15
或
SEQ ID NO:16
的氨基酸残基序列组成的蛋白质；
2)
将序列表中的
SEQ ID NO:15
或
SEQ ID NO:16
的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和
/
或缺失和
/
或添加且与
Cyclobutrifluram
抗性功能相关的由
SEQ ID NO:15
或
SEQ ID NO:16
衍生的蛋白质；其中，自
SEQ ID NO:15
氨基端第
248
位氨基酸
X
为
H
或
Y
；自
SEQ ID NO:16
氨基端第
73
位氨基酸
X
为
A
或
V。2.
权利要求1所述的禾谷镰孢菌对
Cyclobutrifluram
抗性相关蛋白的编码基因
。3.
根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的
DNA
核苷酸序列如下
1)、2)
或
3)
所示：
1)
序列表中
SEQ ID NO:17
或
SEQ ID NO:18
的核苷酸序列；
2)
在严格条件下可与
1)
所述的
DNA
序列重组且编码
Cyclobutrifluram
抗性功能相关蛋白的
DNA
分子；
3)
与序列表中
SEQ ID NO:17
或
SEQ ID NO:18
的核苷酸序列具有
90
％以上的同源性的且编码与
Cyclobutrifluram
抗性功能相关蛋白的
DNA
分子
。4.
含有权利要求2或3所述的编码基因的表达盒
、
重组表达载体或转基因重组菌
。5.
禾谷镰孢菌
FgSdhB
蛋白或禾谷镰孢菌
FgSdhC1蛋白或其编码基因在鉴定禾谷镰孢菌抗药性中的应用
。6.
根据权利要求5所述的应用，其特征在于，通过检测禾谷镰孢菌
FgSdhB
蛋白自
N
端起第
248
位氨基酸是否由组氨酸变为酪氨酸，如果第
248
位氨基酸由组氨酸变为酪氨酸，则其对
Cyclobutrifluram
的抗性提高；以及通过检测禾谷镰孢菌
FgSdhC1蛋白自
N
端起第
73
位氨基酸是否由丙氨酸变为缬氨酸，如果自
N
端起第
73
位氨基酸由丙氨酸变为缬氨酸，则其对
Cyclobutrifluram
抗性提高；其中，禾谷镰孢菌
FgSdhB
蛋白或禾谷镰孢菌
FgSdhC1蛋白为权利要求1所述的蛋白；优选的，通过检测禾谷镰孢菌
FgSdhB
蛋白的编码基因自
5'
端起第
1045
位核苷酸为
T
，如果第
1045
位为
T
，则其对
Cyclobutrifluram
的抗性提高；通过检测禾谷镰孢菌
FgSdhC1蛋白的编码基因自
5'
端起第
428
位核苷酸为
T
，如果第
428
位核苷酸为
T
，则其对
Cyclobutrifluram
的抗性提高；禾谷镰孢菌
FgSdhB
和
FgSdhC1蛋白的编码基因为权利要求2或3所示的编码基因
。7.
一种检测或辅助检测禾谷镰孢菌是否存在突变位点的引物组，为下述
1)
或
2)
所述的引物组：
1)
检测禾谷镰孢菌中
FgSdh B
基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘西莉，苗建强，李怡文，胡世萍，高续恒，代探，李桂香，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：