由肝素衍生的多糖混合物、其制备方法以及含有它们的药物组合物技术

本发明专利技术涉及由肝素衍生的多糖混合物，它们的平均分子量是１５００－３０００道尔顿，抗Ｘａ活性／抗ＩＩａ活性的比大于３０。本发明专利技术还涉及它们的制备方法和含有它们的药物组合物。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请为2003年10月8日提交的专利技术名称为“由肝素衍生的多糖混合物、其制备方法以及含有它们的药物组合物”的PCT申请PCT/FR2003/002960的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2005年4月6日，中请号为200380100992.5。本专利技术涉及由肝素衍生得到的多糖混合物、它们的制备方法以及含有它们的药物组合物。 肝素是一种动物源的硫酸化粘多糖混合物，这种混合物主要因其抗凝血和抗血栓形成性能而得到应用。 然而，肝素本身的缺陷制约着其应用。特别是它的高抗凝血活性(抗IIa活性)可能引起出血。 人们曾提出通过肝素酯的碱解聚作用来得到低分子量肝素(EP40144)；但是，这些产物还是具有高的抗IIa活性。 在US 6 384 021中，也曾描述过极低分子量的肝素。然而，在其中的实施例中测得的抗Xa活性都没有超过120IU，并且测得的抗Xa/抗IIa比是15-50。 在WO 0208295中，采用与US 6384021不同的方法制备出极低分子量的肝素，这些肝素的活性是100-150IU，并且在一些应用实施例中测定的抗Xa/抗IIa比也是非常高的。 尽管如此，人们仍需要提高这类药物的抗Xa活性，尤其是使其活性达到150IU/mg以上，以及提高抗Xa/抗IIa比，因此，需要研制新的肝素衍生物制备方法。 因此，本专利技术的一个目的是通过改进现有技术中描述的方法、特别是通过控制这种解聚步骤时的水百分数，从而来提高抗Xa活性与抗Xa/抗IIa比。由此得到的肝素具有极好的抗血栓形成活性，其抗Xa活性也与肝素的抗Xa活性相近，同时还减少了出血危险性，而且抗IIa活性也非常低。同时，本专利技术产品的半衰期显著高于肝素的半衰期。 因此，本专利技术的目的是一些由肝素衍生得到的新多糖混合物，它们对活化因子X(因子Xa)和活化因子II(因子IIa)的选择性活性优于肝素。 应该理解到，可以将平均分子量1500-3000道尔顿的多糖混合物称之低聚糖。 因此，本专利技术的目的是这些硫酸化低聚糖混合物，它们具有组成肝素的多糖的一般结构，还具有下述特征 -它们的平均分子量是1500-3000道尔顿，抗Xa活性是120-200IU/mg，抗IIa活性小于10IU/mg，抗Xa活性/抗IIa活性的比大于30， -组成这些混合物的低聚糖含有2-26个糖单元，在一个末端有4，5-不饱和糖醛酸2-O-硫酸酯单元，并且含有下式的六糖ΔIIa-IIs-Is 在本专利技术描述的低聚糖混合物中含有的六糖ΔIIa-IIs-Is是一种对ATIII具有高亲合性的序列，其特征在于抗Xa活性高于740U/mg。 本专利技术中描述的低聚糖混合物呈碱金属或碱土金属盐形式。 对于碱金属或碱土金属盐，优选钠、钾、钙和镁盐。 可以采用高压液相色谱法，使用串联双柱，例如以商品名TSK G3000 XL和TSK G2000 XL销售的高压液相色谱仪，测定平均分子量。采用折光计进行检测。使用的洗脱剂是硝酸锂，流速是0.6ml/min。采用琼脂糖-聚丙烯酰胺凝胶层析法(IBF)分馏依诺肝素(AVENTIS)制得的标准品校正这种系统。根据Barrowcliffe等人，《Thromb.Res.》，12，27-36(1977-78)或D.A.Lane等人，《Thromb.Res.》，12，257-271(1977-78)描述的方法进行制备。采用GPC6软件(Perkin Elmer)计算这些结果。 根据Teien等人，《Thromb.Res.》，10，399-410(1977)描述的发色底物酰胺解方法，使用低分子量肝素的第一个国际标准作为标准测定了抗Xa活性。 采用Anderson L.O.等人，《Thromb.Res.》，15，531-541(1979)描述的技术，使用低分子量肝素的第一个国际标准作为标准测定了抗IIa活性。 优选六糖馏分占低聚糖混合物的15-25％。 优选在低聚糖混合物的六糖馏分中，本专利技术的混合物含有8-15％六糖ΔIIa-IIs-Is。 采用高压液相层析法，使用TSK G3000 XL和TSK G2000 XL柱，或者通过制备性分离六糖馏分，可以分析测定六糖馏分的百分数。在这种情况下，使用聚丙烯酰胺琼脂糖类凝胶填充柱，例如从市场上购买商标Ultrogel ACA202R(Biosepra)的填充柱，对这种混合物进行层析分离。用碳酸氢钠溶液洗脱这种混合物。优选地，这种碳酸氢钠溶液是0.1-1mol/l溶液。更优选地，用浓度1mol/l的碳酸氢钠溶液进行这种分离。采用UV光谱法(254nm)进行检测。分馏后，六糖馏分的碳酸氢钠溶液用冰乙酸进行中和。这种溶液然后在减压下浓缩达到乙酸钠浓度高于30重量％。然后加入3-5个体积的甲醇沉淀该六糖馏分。这种六糖馏分再使用3号烧结玻璃过滤器进行过滤回收。得到的六糖混合物可以采用HPLC(高效液相色谱)进行分析，测定六糖ΔIIa-IIs-Is的含量。根据本
的技术人员采用的技术(M.Hook，I.Bjork，J.Hopwood and U.Lindahl，《F.E.B.Sletters》，vol 656(1)(1976))，采用制备性HPLC色谱法或采用亲合色谱法，使用抗凝血酶III琼脂糖柱，可以分离六糖ΔIIa-IIs-Is。 特别优选本专利技术的混合物的抗Xa活性是150-200IU/mg。 优选本专利技术的混合物的抗IIa活性小于5IU/mg，特别优选是0.5-3.5IU/mg。下面描述的这些应用实施例证明当采用该方法优选特征时，本专利技术的混合物的抗IIa活性是1.1-1.6IU/mg。 优选这些混合物的抗Xa活性/抗IIa活性比高于50，特别优选高于100。 优选本专利技术混合物的平均分子量是2000-3000道尔顿，特别优选平均分子量是2400-2650道尔顿。 因此，本专利技术的目的非常特别地是如前面定义的这些混合物，其抗Xa活性是150-200IU/mg，抗IIa活性是0.5-3.5IU/mg，平均分子量是2400-2650道尔顿。 优选地使用pKa大于20的强有机碱(优选地具有类似于例如根据R.Schwesinger等人，《Angew.Chem.Int.Ed.Engl.》26，1167-1169(1987)，R.Schwesinger等人，《Angew.Chem.》105，1420(1993)定义的膦腈类的性质)，在有机介质中，通过肝素苄酯季铵盐的解聚作用，再将解聚的肝素苄酯季铵盐转化成钠盐，这些残留酯进行皂化和任选地纯化，这样可以制备出本专利技术的低聚糖混合物。本专利技术方法重复了如在WO 0208295中所述方法的主要步骤，同时增加一个基本特征，这种特征能够使所得到的本专利技术低聚糖混合物具有前面描述的物理化学特征和活性。 事实上，为了得到本专利技术的特定低聚糖混合物，需要在解聚步骤时，通过非常精确控制在这种混合物中的水含量来控制这种碱的选择性。 事实上，本专利技术方法的特征在于在解聚作用时控制这种碱的高选择性。本专利技术能够使这种肝素解聚，同时最大限度地保持这些对ATIII亲合性的序列，例如本专利技术中描述的六糖ΔIIa-IIs-Is。该方法的这个关键步骤确保能够得到本专利技术的多糖。 所述方法的这个特征使得这种平均分本文档来自技高网...

【技术保护点】
根据下面所述的低聚糖作为药物。所述硫酸化低聚糖混合物，它们具有组成肝素的多糖的一般结构，还具有下述特征：－它们的平均分子量是１５００－３０００道尔顿，抗Ⅹａ活性是１２０－２００ＩＵ／ｍｇ，抗Ⅱａ活性小于１０ＩＵ／ｍｇ，抗Ⅹａ活性／抗Ⅱａ活性的比大于３０，　　这些混合物的组分低聚糖：　　－含有２－２６个糖单元，　　－在其中一个末端有４，５－不饱和糖醛酸２－Ｏ－硫酸酯单元，　　－含有下式的六糖ΔⅡａ－Ⅱｓ－Ⅰｓ：＊＊＊并且这些低聚糖混合物呈碱金属或碱土金属盐形式。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：V比贝尔罗维科，L格龙达尔，P穆里耶，C维斯科夫，
申请(专利权)人：安万特医药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]