突变制造技术

本发明专利技术涉及位于外模

【技术实现步骤摘要】
突变CSGG孔
[0001]本专利申请是申请号为
201580059505.8、
申请日为
2015
年9月1日
、
专利技术名称为“突变
CSGG
孔”的专利申请的分案申请
。


[0002]本专利技术涉及一种新型蛋白孔及其用途
。
特别地，其涉及在核酸测序应用及分子感测中的生物纳米孔
。
[0003]本专利技术涉及
CsgG
的突变形式
。
本专利技术还涉及采用
CsgG
的分析物检测和表征
。

技术介绍

[0004]蛋白孔是形成膜中通道的跨膜多肽和复合物，离子和某些分子可以通过该通道
。
所述通道的最小直径典型的处在纳米范围内
(10
‑9米
)
，因此将这些多肽中的某些命名为“纳米孔”。
[0005]纳米孔具有作为生物传感器的巨大潜力
。
当结合在膜上的纳米孔被施加电势时，离子从所述通道中流过
。
该离子流可以作为电流被测量
。
例如，
WO2000/28312
和
D.Stoddart et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,2010,106,7702
‑7中描述了使用单通道记录设备的合适的电学检测技术
。
例如，
WO2009/077734
中描述了多通道记录技术
。
[0006]通过所述孔，或结合到所述孔中或接近所述孔的分子转录用于阻碍并从而降低通过所述通道的离子流
。
离子流的降低程度指示孔内或其附近的阻塞的尺寸，该离子流降低程度通过电流的下降进行测量
。
因此被测量的电流可以用于测量通道阻塞的大小或程度
。
电流的变化可以用于识别分子或分子的一部分已经在所述孔
(
分子传感
)
或接近所述孔或在特定体系中结合，其可以用于基于分子大小测定位于孔内分子的身份
(
核酸测序
)。
[0007]“链测序”方法是已知的采用生物纳米孔对核酸进行测序的方法
。
将单链多核苷酸通过纳米孔，当它们瞬时穿过纳米孔通道时，每个核苷酸上的碱基通过检测电流的变化进行测定
。
该方法相对于核酸测序的传统方法节省了大量时间和成本
。
[0008]之前报道的蛋白纳米孔，例如突变体
MspA(Manrao et al.,Nature Biotechnology,2012,30(4),349
‑
353)
以及
α
‑
溶血素纳米孔
(Nat.Nanotechnol.,2009,4(4),265
‑
70)
已经用于使用“链测序”方法的核酸测序
。
相似地，对于蛋白传感其他孔例如
α
‑
溶血素
(J Am Chem Soc,2012,134(5),2781
‑
7)
和
ClyA(Am.Chem.Soc.Nano.2014,8(12),12826
‑
35)(J.Am.Chem.Soc,2013,135(36),13456
‑
63)
也已经被采用
。
[0009]对克服现有技术缺陷的新型纳米孔的需求依然存在，尤其是优化用于分子传感应用和例如核酸测序应用的孔的维度和特征
。
[0010]纳米孔传感是一种依靠观察个体结合或分析物分子和受体间相互作用的传感方法
。
纳米孔传感器可以通过在绝缘膜中放置纳米维度的单孔并测量在分析物分子存在下通过该孔的电压驱动的离子传输而产生
。
分析物的识别通过其独特的电流信号
、
显著的持续时间和电流块的范围以及电流水平的变化显示出来
。
[0011]现在存在对快速且便宜
、
应用范围广泛的核酸
(
例如
DNA
或
RNA)
测序技术的需求
。
现有技术速度慢并且价格昂贵主要是因为其依赖扩增技术产生大量核酸并需要大量的用于信号检测的专用荧光化学物质
。
纳米孔传感有潜力通过减少核苷酸和所需试剂用量而提供一种快速且便宜的核酸测序方法
。
[0012]采用纳米孔传感进行核酸测序的两个必要组分是
(1)
控制核酸移动通过该孔；和
(2)
核酸聚合物移动通过孔时对核苷酸的识别
。
在过去，为实现核苷酸的识别，使核酸穿过溶血素的突变体
。
这会提供电流信号，该电流信号显示是由序列决定的
。
这也表明当使用溶血素孔时，大量的核苷酸有助于观测电流，使得观测电流和多核苷酸之间的直接关系令人深思
。
[0013]虽然通过溶血素孔的突变已经改善了用于识别核苷酸的电流范围，但是如果核苷酸之间的电流差异进一步提高，则测序系统将具有更好的性能
。
另外，观察到，当核酸移动通过孔时，某些电流状态表现出高变化性
。
还显示，某些突变溶血素孔比其他的展现出更高的变化性
。
虽然这些状态的变化可以包含序列的特异性信息，但是希望产生具有低变化性的孔来简化该系统
。
还期望减少有助于观测到的电流的核苷酸的数量
。

技术实现思路

[0014]专利技术人已经鉴定出细菌淀粉样蛋白分泌通道
CsgG
的结构
。
所述
CsgG
通道是一种跨膜寡聚蛋白，其形成最小直径约为
0.9nm
的通道
。CsgG
纳米孔的结构使其适合用于蛋白质传感应用中，特别是用于核酸测序
。CsgG
多肽的修饰变体可以用于进一步增强所述通道对上述特定应用的适用性
。
[0015]因为其结构更适合于
DNA
测序应用，
CsgG
孔较现有蛋白质孔例如
ClyA
或
α
‑
溶血素具有优势
。CsgG
孔具有更有利的纵横比，包括比
ClyA
具有更短的跨膜通道
。CsgG
孔与
α
‑
溶血素孔相比具有更宽的通道开口
。
对于某些应用，这可以促进酶的附着，例如对于核酸测序应用
。
在这些实施方式中，其也可以使位于酶和读取头
(
定义为孔的最窄部分
)
之间的核酸链段的长度最小化，从而导致改善的读出信号
。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种包括插入体外膜中的跨膜蛋白孔的设备，其中所述跨膜蛋白孔包括至少一个
CsgG
单体，所述
CsgG
单体在对应于
SEQ ID NO:390
中所示序列的
Y51、N55
和
F56
的两个或两个以上位置处具有氨基酸突变
。2.
根据权利要求1所述的设备，其中所述至少一个
CsgG
单体在对应于
Y51/N55、Y51/F56、N55/F56
或
Y51/N55/F56
的位置包括突变
。3.
根据权利要求1所述的设备，其中所述至少一个
CsgG
单体包括对应于如下的突变：
F56N/N55Q、F56N/N55R、F56N/N55K、F56N/N55S、F56N/N55G、F56N/N55A、F56N/N55T、F56Q/N55Q、F56Q/N55R、F56Q/N55K、F56Q/N55S、F56Q/N55G、F56Q/N55A、F56Q/N55T、F56R/N55Q、F56R/N55R、F56R/N55K、F56R/N55S、F56R/N55G、F56R/N55A、F56R/N55T、F56S/N55Q、F56S/N55R、F56S/N55K、F56S/N55S、F56S/N55G、F56S/N55A、F56S/N55T、F56G/N55Q、F56G/N55R、F56G/N55K、F56G/N55S、F56G/N55G、F56G/N55A、F56G/N55T、F56A/N55Q、F56A/N55R、F56A/N55K、F56A/N55S、F56A/N55G、F56A/N55A、F56A/N55T、F56K/N55Q、F56K/N55R、F56K/N55K、F56K/N55S、F56K/N55G、F56K/N55A、F56K/N55T、F56N/Y51L、F56N/Y51V、F56N/Y51A、F56N/Y51N、F56N/Y51Q、F56N/Y51S、F56N/Y51G、F56Q/Y51L、F56Q/Y51V、F56Q/Y51A、F56Q/Y51N、F56Q/Y51Q、F56Q/Y51S、F56Q/Y51G、F56R/Y51L、F56R/Y51V、F56R/Y51A、F56R/Y51N、F56R/Y51Q、F56R/Y51S、F56R/Y51G、F56S/Y51L、F56S/Y51V、F56S/Y51A、F56S/Y51N、F56S/Y51Q、F56S/Y51S、F56S/Y51G、F56G/Y51L、F56G/Y51V、F56G/Y51A、F56G/Y51N、F56G/Y51Q、F56G/Y51S、F56G/Y51G、F56A/Y51L、F56A/Y51V、F56A/Y51A、F56A/Y51N、F56A/Y51Q、F56A/Y51S、F56A/Y51G、F56K/Y51L、F56K/Y51V、F56K/Y51A、F56K/Y51N、F56K/Y51Q、F56K/Y51S、F56K/Y51G、N55Q/Y51L、N55Q/Y51V、N55Q/Y51A、N55Q/Y51N、N55Q/Y51Q、N55Q/Y51S、N55Q/Y51G、N55R/Y51L、N55R/Y51V、N55R/Y51A、N55R/Y51N、N55R/Y51Q、N55R/Y51S、N55R/Y51G、N55K/Y51L、N55K/Y51V、N55K/Y51A、N55K/Y51N、N55K/Y51Q、N55K/Y51S、N55K/Y51G、N55S/Y51L、N55S/Y51V、N55S/Y51A、N55S/Y51N、N55S/Y51Q、N55S/Y51S、N55S/Y51G、N55G/Y51L、N55G/Y51V、N55G/Y51A、N55G/Y51N、N55G/Y51Q、N55G/Y51S、N55G/Y51G、N55A/Y51L、N55A/Y51V、N55A/Y51A、N55A/Y51N、N55A/Y51Q、N55A/Y51S、N55A/Y51G、N55T/Y51L、N55T/Y51V、N55T/Y51A、N55T/Y51N、N55T/Y51Q、N55T/Y51S、N55T/Y51G、F56N/N55Q/Y51L、F56N/N55Q/Y51V、F56N/N55Q/Y51A、F56N/N55Q/Y51N、F56N/N55Q/Y51Q、F56N/N55Q/Y51S、F56N/N55Q/Y51G、F56N/N55R/Y51L、F56N/N55R/Y51V、F56N/N55R/Y51A、F56N/N55R/Y51N、F56N/N55R/Y51Q、F56N/N55R/Y51S、F56N/N55R/Y51G、F56N/N55K/Y51L、F56N/N55K/Y51V、F56N/N55K/Y51A、F56N/N55K/Y51N、F56N/N55K/Y51Q、F56N/N55K/Y51S、F56N/N55K/Y51G、F56N/N55S/Y51L、F56N/N55S/Y51V、F56N/N55S/Y51A、F56N/N55S/Y51N、F56N/N55S/Y51Q、F56N/N55S/Y51S、F56N/N55S/Y51G、F56N/N55G/Y51L、F56N/N55G/Y51V、F56N/N55G/Y51A、F56N/N55G/Y51N、F56N/N55G/Y51Q、F56N/N55G/Y51S、F56N/N55G/Y51G、F56N/N55A/Y51L、F56N/N55A/Y51V、F56N/N55A/Y51A、F56N/N55A/Y51N、F56N/N55A/Y51Q、F56N/N55A/Y51S、F56N/N55A/Y51G、F56N/N55T/Y51L、F56N/N55T/Y51V、F56N/N55T/Y51A、F56N/N55T/Y51N、F56N/N55T/Y51Q、F56N/N55T/Y51S、F56N/N55T/Y51G、F56Q/N55Q/Y51L、F56Q/N55Q/Y51V、F56Q/N55Q/Y51A、F56Q/N55Q/Y51N、F56Q/N55Q/Y51Q、F56Q/N55Q/Y51S、F56Q/N55Q/Y51G、F56Q/N55R/Y51L、F56Q/N55R/Y51V、F56Q/N55R/Y51A、F56Q/N55R/Y51N、F56Q/N55R/Y51Q、F56Q/N55R/Y51S、F56Q/N55R/Y51G、F56Q/N55K/Y51L、F56Q/N55K/Y51V、F56Q/N55K/Y51A、F56Q/N55K/Y51N、
F56Q/N55K/Y51Q、F56Q/N55K/Y51S、F56Q/N55K/Y51G、F56Q/N55S/Y51L、F56Q/N55S/Y51V、F56Q/N55S/Y51A、F56Q/N55S/Y51N、F56Q/N55S/Y51Q、F56Q/N55S/Y51S、F56Q/N55S/Y51G、F56Q/N55G/Y51L、F56Q/N55G/Y51V、F56Q/N55G/Y51A、F56Q/N55G/Y51N、F56Q/N55G/Y51Q、F56Q/N55G/Y51S、F56Q/N55G/Y51G、F56Q/N55A/Y51L、F56Q/N55A/Y51V、F56Q/N55A/Y51A、F56Q/N55A/Y51N、F56Q/N55A/Y51Q、F56Q/N55A/Y51S、F56Q/N55A/Y51G、F56Q/N55T/Y51L、F56Q/N55T/Y51V、F56Q/N55T/Y51A、F56Q/N55T/Y51N、F56Q/N55T/Y51Q、F56Q/N55T/Y51S、F56Q/N55T/Y51G、F56R/N55Q/Y51L、F56R/N55Q/Y51V、F56R/N55Q/Y51A、F56R/N55Q/Y51N、F56R/N55Q/Y51Q、F56R/N55Q/Y51S、F56R/N55Q/Y51G、F56R/N55R/Y51L、F56R/N55R/Y51V、F56R/N55R/Y51A、F56R/N55R/Y51N、F56R/N55R/Y51Q、F56R/N55R/Y51S、F56R/N55R/Y51G、F56R/N55K/Y51L、F56R/N55K/Y51V、F56R/N55K/Y51A、F56R/N55K/Y51N、F56R/N55K/Y51Q、F56R/N55K/Y51S、F56R/N55K/Y51G、F56R/N55S/Y51L、F56R/N55S/Y51V、F56R/N55S/Y51A、F56R/N55S/Y51N、F56R/N55S/Y51Q、F56R/N55S/Y51S、F56R/N55S/Y51G、F56R/N55G/Y51L、F56R/N55G/Y51V、F56R/N55G/Y51A、F56R/N55G/Y51N、F56R/N55G/Y51Q、F56R/N55G/Y51S、F56R/N55G/Y51G、F56R/N55A/Y51L、F56R/N55A/Y51V、F56R/N55A/Y51A、F56R/N55A/Y51N、F56R/N55A/Y51Q、F56R/N55A/Y51S、F56R/N55A/Y51G、F56R/N55T/Y51L、F56R/N55T/Y51V、F56R/N55T/Y51A、F56R/N55T/Y51N、F56R/N55T/Y51Q、F56R/N55T/Y51S、F56R/N55T/Y51G、F56S/N55Q/Y51L、F56S/N55Q/Y51V、F56S/N55Q/Y51A、F56S/N55Q/Y51N、F56S/N55Q/Y51Q、F56S/N55Q/Y51S、F56S/N55Q/Y51G、F56S/N55R/Y51L、F56S/N55R/Y51V、F56S/N55R/Y51A、F56S/N55R/Y51N、F56S/N55R/Y51Q、F56S/N55R/Y51S、F56S/N55R/Y51G、F56S/N55K/Y51L、F56S/N55K/Y51V、F56S/N55K/Y51A、F56S/N55K/Y51N、F56S/N55K/Y51Q、F56S/N55K/Y51S、F56S/N55K/Y51G、F56S/N55S/Y51L、F56S/N55S/Y51V、F56S/N55S/Y51A、F56S/N55S/Y51N、F56S/N55S/Y51Q、F56S/N55S/Y51S、F56S/N55S/Y51G、F56S/N55G/Y51L、F56S/N55G/Y51V、F56S/N55G/Y51A、F56S/N55G/Y51N、F56S/N55G/Y51Q、F56S/N55G/Y51S、F56S/N55G/Y51G、F56S/N55A/Y51L、F56S/N55A/Y51V、F56S/N55A/Y51A、F56S/N55A/Y51N、F56S/N55A/Y51Q、F56S/N55A/Y51S、F56S/N55A/Y51G、F56S/N55T/Y51L、F56S/N55T/Y51V、F56S/N55T/Y51A、F56S/N55T/Y51N、F56S/N55T/Y51Q、F56S/N55T/Y51S、F56S/N55T/Y51G、F56G/N55Q/Y51L、F56G/N55Q/Y51V、F56G/N55Q/Y51A、F56G/N55Q/Y51N、F56G/N55Q/Y51Q、F56G/N55Q/Y51S、F56G/N55Q/Y51G、F56G/N55R/Y51L、F56G/N55R/Y51V、F56G/N55R/Y51A、F56G/N55R/Y51N、F56G/N55R/Y51Q、F56G/N55R/Y51S、F56G/N55R/Y51G、F56G/N55K/Y51L、F56G/N55K/Y51V、F56G/N55K/Y51A、F56G/N55K/Y51N、F56G/N55K/Y51Q、F56G/N55K/Y51S、F56G/N55K/Y51G、F56G/N55S/Y51L、F56G/N55S/Y51V、F56G/N55S/Y51A、F56G/N55S/Y51N、F56G/N55S/Y51Q、F56G/N55S/Y51S、F56G/N55S/Y51G、F56G/N55G/Y51L、F56G/N55G/Y51V、F56G/N55G/Y51A、F56G/N55G/Y51N、F56G/N55G/Y51Q、F56G/N55G/Y51S、F56G/N55G/Y51G、F56G/N55A/Y51L、F56G/N55A/Y51V、F56G/N55A/Y51A、F56G/N55A/Y51N、F56G/N55A/Y51Q、F56G/N55A/Y51S、F56G/N55A/Y51G、F56G/N55T/Y51L、F56G/N55T/Y51V、F56G/N55T/Y51A、F56G/N55T/Y51N、F56G/N55T/Y51Q、F56G/N55T/Y51S、F56G/N55T/Y51G、F56A/N55Q/Y51L、F56A/N55Q/Y51V、F56A/N55Q/Y51A、F56A/N55Q/Y51N、F56A/N55Q/Y51Q、F56A/N55Q/Y51S、F56A/N55Q/Y51G、F56A/N55R/Y51L、F56A/N55R/Y51V、F56A/N55R/Y51A、F56A/N55R/Y51N、F56A/N55R/Y51Q、F56A/N55R/Y51S、F56A/N55R/Y51G、F56A/N55K/Y51L、F56A/N55K/Y51V、F56A/N55K/Y51A、
F56A/N55K/Y51N、F56A/N55K/Y51Q、F56A/N55K/Y51S、F56A/N55K/Y51G、F56A/N55S/Y51L、F56A/N55S/Y51V、F56A/N55S/Y51A、F56A/N55S/Y51N、F56A/N55S/Y51Q、F56A/N55S/Y51S、F56A/N55S/Y51G、F56A/N55G/Y51L、F56A/N55G/Y51V、F56A/N55G/Y51A、F56A/N55G/Y51N、F56A/N55G/Y51Q、F56A/N55G/Y51S、F56A/N55G/Y51G、F56A/N55A/Y51L、F56A/N55A/Y51V、F56A/N55A/Y51A、F56A/N55A/Y51N、F56A/N55A/Y51Q、F56A/N55A/Y51S、F56A/N55A/Y51G、F56A/N55T/Y51L、F56A/N55T/Y51V、F56A/N55T/Y51A、F56A/N55T/Y51N、F56A/N55T/Y51Q、F56A/N55T/Y51S、F56A/N55T/Y51G、F56K/N55Q/Y51L、F56K/N55Q/Y51V、F56K/N55Q/Y51A、F56K/N55Q/Y51N、F56K/N55Q/Y51Q、F56K/N55Q/Y51S、F56K/N55Q/Y51G、F56K/N55R/Y51L、F56K/N55R/Y51V、F56K/N55R/Y51A、F56K/N55R/Y51N、F56K/N55R/Y51Q、F56K/N55R/Y51S、F56K/N55R/Y51G、F56K/N55K/Y51L、F56K/N55K/Y51V、F56K/N55K/Y51A、F56K/N55K/Y51N、F56K/N55K/Y51Q、F56K/N55K/Y51S、F56K/N55K/Y51G、F56K/N55S/Y51L、F56K/N55S/Y51V、F56K/N55S/Y51A、F56K/N55S/Y51N、F56K/N55S/Y51Q、F56K/N55S/Y51S、F56K/N55S/Y51G、F56K/N55G/Y51L、F56K/N55G/Y51V、F56K/N55G/Y51A、F56K/N55G/Y51N、F56K/N55G/Y51Q、F56K/N55G/Y51S、F56K/N55G/Y51G、F56K/N55A/Y51L、F56K/N55A/Y51V、F56K/N55A/Y51A、F56K/N55A/Y51N、F56K/N55A/Y51Q、F56K/N55A/Y51S、F56K/N55A/Y51G、F56K/N55T/Y51L、F56K/N55T/Y51V、F56K/N55T/Y51A、F56K/N55T/Y51N、F56K/N55T/Y51Q、F56K/N55T/Y51S、F56K/N55T/Y51G、F56E/N55R、F56E/N55K、F56D/N55R、F56D/N55K、F56R/N55E、F56R/N55D、F56K/N55E
或
F56K/N55D。4.
根据权利要求1所述的设备，其中所述跨膜蛋白孔是异源寡聚孔
。5.
根据权利要求4所述的设备，其中所述异源寡聚孔包括九个
CsgG
单体，并且其中所述九个
CgG
单体中的至少一个不同于其它的
CsgG
单体
。6.
根据权利要求4所述的设备，其中所述异源寡聚孔包括不是
...

【专利技术属性】
技术研发人员：汉，
申请(专利权)人：布鲁塞尔自由大学牛津纳米孔科技公开有限公司，
类型：发明
国别省市：