一种蒙古鲌胚胎冷冻保存的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体公开了一种蒙古鲌胚胎冷冻保存的方法，

【技术实现步骤摘要】
一种蒙古鲌胚胎冷冻保存的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体为生物材料
/
组织冷冻保存领域，尤其是鱼类胚胎冷冻保存
。

技术介绍

[0002]由于鱼胚体积大
(
直径为
≥1mm)、
双层膜结构
、
绒毛膜通透性差
、
卵黄囊含水量多等特点
,
其冷冻保存比哺乳类胚胎困难许多
。
到目前为止
,
只有极少数品种的鱼胚能够成功冷冻保存
。
对于鱼类胚胎等大体积的生物样本，冷冻保存的方法通常只能采用玻璃化法，玻璃化法是一种利用较高的抗冻剂浓度与极快的降温速率，使溶液达到无冰晶的玻璃化状态，从而减少生物样品受到的机械损伤的一种方法
。
该方法因其简便
、
快速
、
低成本以及更好地保护胚胎避免受到冷冻带来的细胞损伤已被广泛采用
。Zhang
等人使用含有丙二醇
、
甲醇
、
甘油
、
蔗糖的冷冻保护剂对石斑鱼胚胎进行了超低温保存的初步研究
,
得到了
6.32
％的存活率，存活胚胎中有
39.85
％最终孵化成功
。
丁等人采用程序降温方法和玻璃化方法对真鲷胚胎冷冻进行保存，取得液氮区胚胎冷冻复活的突破性进展
,
然后通过检测胚胎存活率，得到结果丙二醇对真鲷胚胎的毒性最低，毒性最高的为甲醇
。
[0003]中国水产科学研究院黄海水产研究所的陈松林和田永胜教授曾发表关于海水鱼类胚胎玻璃化冷冻保存方法
。
方案如下：鱼类胚胎收集：选用出膜前期的胚胎；玻璃化液配制：是基础液和抗冻剂的混合液，基础液
(BS2)
为：
NaCl 2.472
％
、KCl 0.086
％
、CaCl2·
2H2O 0.146
％
、MgCl2·
6H2O 0.486
％
、NaHCO
3 0.019
％；抗冻剂为：1，2‑
丙二醇
(PG)、
甲醇
(MeOH)
；玻璃化液配方是：
BS2
：
50
‑
67
％，
PG
：
20
‑
30
％，
MeOH
：
13
‑
20
％；胚胎冷冻前的平衡处理：将胚胎逐级依次在浓度为
25
％
、33
％
、50
％
、67
％及
100
％的玻璃化液中分五次进行平衡处理，处理
45
‑
55min
，每步9‑
11min
；液氮中速冻保存：将平衡好的胚胎9‑
13
粒连同
250ul
的玻璃化液吸入到直径
3mm、
长
10cm
麦管内，热压封口后，以
2000℃/min
的降温速率投入到
‑
196℃
液氮中速冻保存；解冻和培育：将麦管从液氮中移出，在1‑2秒内快速插入
39
‑
40℃
水浴中使其迅速解冻，在胚胎乳白色即将消失时，剪开麦管，用
2ml 0.125M
的蔗糖洗脱液，将胚胎冲入器皿中进行洗脱，时间为
10min
，之后添加
14
‑
16℃
灭菌海水进行培育
。
[0004]由于现有技术缺少针对淡水经济鱼类蒙古鲌胚胎的冷冻保存技术；同时，现有技术采用
0.25mL
麦管保存鱼类胚胎，保存方式粗糙，降温升温无法做到均匀稳定，保存效果不佳
。
另外，现有技术无法完全避免玻璃化溶液复温过程中的重结晶现象，实验结果存在偶然性，可重复性较差
。

技术实现思路

[0005]针对现有技术缺乏针对淡水经济鱼类蒙古鲌的胚胎的冷冻保存技术的问题，本专利技术提供一种蒙古鲌胚胎冷冻保存液试剂盒及冷冻保存方法，以克服现有技术的不足
。
[0006]一种蒙古鲌胚胎冷冻保存的方法，包括如下步骤：
[0007](1)
蒙古鲌胚胎先后在平衡液一
ES1
和平衡液二
ES2
中，分别平衡8‑
12min
；
[0008]将冷冻保护剂与稀释液按1：
1.8
‑
2.4
体积比混合配制平衡液一；将冷冻保护剂与稀释液按
1.8
‑
2.4:1
体积比混合配制平衡液二；
[0009]所述稀释液以水作为溶剂，含有6‑
10g/L
氯化钠
、0.3
‑
0.7g/L
氯化钾
、12
‑
18g/L
葡萄糖；
[0010]所述冷冻保护剂以水为溶剂，含有体积分数8％
‑
15
％甲醇
、
体积分数
10
％
‑
20
％丙二醇
、
体积分数
10
％
‑
20
％二甲基亚砜，并含有
3.5
‑
5.0g/L
氯化钠
、0.2
‑
0.4g/L
氯化钾
、7
‑
11g/L
葡萄糖
、0.5
‑
1.5mmol/L
褪黑素和
0.5
‑
1.5mg/L Fe3O4磁性纳米微球；
[0011](2)
蒙古鲌胚胎转移至冷冻保护剂
CPA
中，收集单个蒙古鲌胚胎，置于液氮冷却的金属块上8‑
12s
，放于冻存容器内并封口，保存于液氮中
。
[0012]优选的，所述的蒙古鲌胚胎处于尾芽期
。
[0013]Fe3O4磁性纳米微球粒径为
100
‑
800nm
，优选的，
Fe3O4磁性纳米微球粒径为
500
‑
600nm。
[0014]优选的，可以用上述稀释液为溶剂，加入甲醇
、
丙二醇
、
二甲基亚砜
、
褪黑素和
Fe3O4磁性纳米微球配制冷冻保护剂，其中稀释液的体积分数为
50
％
‑
70
％
。
[0015]优选的，所述稀本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种蒙古鲌胚胎冷冻保存的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)
蒙古鲌胚胎先后在平衡液一和平衡液二中，分别平衡8‑
12min
；将冷冻保护剂与稀释液按1：
1.8
‑
2.4
体积比混合配制平衡液一；将冷冻保护剂与稀释液按
1.8
‑
2.4:1
体积比混合配制平衡液二；所述稀释液以水作为溶剂，含有6‑
10g/L
氯化钠
、0.3
‑
0.7g/L
氯化钾
、12
‑
18g/L
葡萄糖；所述冷冻保护剂含有体积分数8％
‑
15
％甲醇
、
体积分数
10
％
‑
20
％丙二醇
、
体积分数
10
％
‑
20
％二甲基亚砜，并含有
3.5
‑
5.0g/L
氯化钠
、0.2
‑
0.4g/L
氯化钾
、7
‑
11g/L
葡萄糖
、0.5
‑
1.5mmol/L
褪黑素和
0.5
‑
1.5mg/L Fe3O4磁性纳米微球；
(2)
蒙古鲌胚胎转移至冷冻保护剂中，收集单个蒙古鲌胚胎，置于液氮冷却的金属块上8‑
12s
，放于冻存容器内并封口，保存于液氮中
。2.
根据权利要求1所述一种蒙古鲌胚胎冷冻保存的方法，其特征在于，所述平衡液一由冷冻保护剂与稀释液按1：2体积比混合而成；所述平衡液二由冷冻保护剂与稀释液按
2:1
体积比混合而成
。3.
根据权利要求1所述一种蒙古鲌胚胎冷冻的方法，其特征在于，步骤
(1)
中，卵母细胞在平衡液一和平衡液二中，分别平衡
10min。4.
根据权利要求1所述一种蒙古鲌胚胎冷冻的方法，其特征在于，所述稀释液含有7‑
9g/L
氯化钠
、0.4
‑
0.6g/L
氯化钾
、14
‑
16g/L
葡萄糖；所述冷冻保护剂含有体积分数9％
‑
12
％甲醇
、
体积分数
12
％
‑
16
％丙二醇
、
体积分数
12
％
‑
16
％二甲基亚砜，并含有
3.5
‑
5.0g/L
氯化钠
、0.2
‑
0.4g/L
氯化钾
、8
‑
10g/L
葡萄糖
、0.8
‑
1.2mmol/L
褪黑素和
0.8
‑
1.2mg/L Fe3O4磁性纳米微球
。5.
根据权利要求1所述一种蒙古鲌胚胎冷冻的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张俊芳，韩兵社，蔡心清，张全根，朱晶晶，郭冰玉，李鑫，张杰，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：