湖北百合制造技术

本发明专利技术公开了湖北百合

【技术实现步骤摘要】
湖北百合microRNA荧光定量内参基因的筛选方法和应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学，特别是涉及一种湖北百合生长发育进程中
microRNA
荧光定量内参基因的筛选方法和应用
。

技术介绍

[0002]百合
(Lilium spp.)
是世界上最重要的花卉作物之一，百合表现出许多园艺特征，以其多样化的花色和花型而闻名，广泛应用于庭院美化和切花市场
。
百合的生长发育涉及一系列的生化过程，而在细胞增殖分化
、
生长发育和响应外界环境信号等多种生物过程中
miRNA(microRNA)
发挥重要作用
。1993
年和
2000
年，
Ambros
与
Reinhart
的研究小组分别先后在线虫中鉴定了最早的动物
miRNA
，
lin
‑4和
let
‑
7。2002
年首次在拟南芥和水稻中发现植物
miRNA
以来，在许多模式生物和细胞中找到了上百个类似的小分子
RNA
，并且将其命名为
miRNA
，
miRNA
是一类长度约为
20
‑
22nt
核苷酸的单链非编码
RNA
分子，通过与靶基因的
mRNA
结合，调控基因的表达
。
成熟的
miRNA
与
AGO
家族蛋白结合后被组装成沉默复合体
RISC
，与靶基因的
mRNA
结合并介导其降解或翻译抑制，进而调控靶基因表达
。
从而对结构基因及转录因子等具有重要的调控作用，从而在转录后水平上调控该基因的表达
。
这些研究揭示了植物基因调控网络的复杂性，所以近年来对
miRNA
的研究已经成为一个前沿的热点问题
。
在葡萄中发现
miR858
调节
VvMYB114
，促进了花青素和黄酮醇积累
。
在荔枝中，
miR828、miR319、miR159
和
miR858
，共同靶向多个
LcMYB
基因
。
核黄素介导了
miR408
靶向的
m(6)A
修饰，在龙眼中促进早期体细胞胚胎发生
。
蓝莓中一种花青素结构基因
F3H
被鉴定为
vas
‑
miR167a
的靶标基因，它与
vas
‑
miR167a
的表达水平呈正相关，因此推测蓝莓
miR167a
正调控花青素的合成
。
由
miR1119
和
MYC2
组成的调控模块可能在小麦的耐旱性中发挥重要作用
。
在拟南芥中
miR156/SPL9
模块使植物能够对环境的温度和光照变化做出生长可塑性的响应
。
[0003]而在百合中也有相关
miRNA
的研究，
2017
年，小
RNA
和转录组测序揭示了在
Lilium pumilum DC.Fisch
的体细胞胚胎发生过程中可能存在的
miRNA
介导的相互作用网络
。2020
年，
Yamagishi
发现
MicroRNA828
‑
MYB12
模块介导了亚洲杂交百合花瓣双色模式
。2021
年，揭示了东方杂交百合中与花的颜色相关的
mRNA
‑
小
RNA
调控网络
。2021
年，张倩等人通过对
miRNA
文库
、
降解组和转录组中表达谱的相关性分析，发现
miR156a
‑
LfSPL2、miR172a
‑
LfAP2、miR164a
‑
LfNAC
以及
miR159a
‑
LfSPL2
与开花相关
。
[0004]如何精准检测
miRNA
是否表达及表达量是
miRNA
研究的基础，而内参基因的不稳定表达可能导致最终结果的偏差，因此筛选稳定表达的
miRNA
作为内参基因，可以更准确地通过比较不同
miRNA
在生长发育过程中的表达水平，深入了解
miRNA
在调控生长发育过程中的功能和机制
。
其中
qRT
‑
PCR
以其灵敏度高
、
特异性强
、
操作简便等优势，已成为基因检测的首选方法
。
由于
miRNA
长度短小，
miRNA
的
qRT
‑
PCR
与普通
PCR
不同，前者需延长待测
miRNA
的长度，构建出足够长的
PCR
模板
。
目前，基于茎环法和
poly(A)
法设计特异引物，采用
qRT
‑
PCR
技术成为
miRNA
的常用检测方法，但是茎环法要比
poly(A)
法更特异和敏感
。
同时，由于
RNA
数量和质量等因素可能会影响
miRNA
的检测效果，常规
qRT
‑
PCR
的内参基因不一定适合作为
miRNA
表达分析的内参基因
。
因此，为了准确测量
miRNA
的表达水平，设计特异引物以及选择适宜的内参基因成为植物
miRNA
表达水平分析的关键
。
[0005]在百合生长发育研究中，已经有一些研究报道了在该过程中适用的
miRNA
或
mRNA
内参，比如在百合体细胞胚胎中，以
lpu
‑
miR159a
和
F
‑
box family protein(FP)
为内参基因；在
Lilium
×
formolongi
中，以
5S RNA
和
EF
为内参基因；在
OT(
东方
×
喇叭
)
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.osa
‑
miR166m、osa
‑
miR166g
‑
3p
和
osa
‑
miR166a
‑
3p
基因作为内参基因在湖北百合
microRNA
荧光定量
PCR
分析中的应用；在不同发育时期的花瓣间分析时，采用
osa
‑
miR166m
和
osa
‑
miR166a
‑
3p
基因作为内参基因；在不同组织间分析时，采用
osa
‑
miR166g
‑
3p
和
osa
‑
miR166a
‑
3p
基因作为内参基因
。2.
根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述
osa
‑
miR166m
的核苷酸序列如序列表中
SEQ ID NO.1
所示，所述
osa
‑
miR166g
‑
3p
的核苷酸序列如序列表中
SEQ ID NO.2
所示，所述
osa
‑
miR166a
‑
3p
的核苷酸序列如序列表中
SEQ ID NO.3
所示
。3.
一种用于扩增权利要求1所述的内参基因的专用引物，其特征在于：所述
osa
‑
miR166m
基因的引物序列如序列表中
SEQ ID NO.4
和
SEQ ID NO.5
所示；所述
osa
‑
miR166g
‑
3p
基因的引物序列如序列表中
SEQ ID NO.6
和
SEQ ID NO.7
所示；所述
osa
‑
miR166a
‑
3p
基因的引物序列如序列表中
SEQ ID NO.8
和
SEQ ID NO.9
所示
。4.
权利要求3所述的专用引物在湖北百合实时荧光定量
PCR
分析中的应用
。5.
一种湖北百合实时荧光定量
PCR
分析中内参基因的筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)
准备材料，包括不同花发育时期和不同组织的湖北百合样品；
(2)miRNA
的提取与反转录；
(3)
候选内参基因的筛选与引物设计：
(4)
候选内参基因的
qRT
‑
PCR

【专利技术属性】
技术研发人员：张铭芳，金鸽，张秀海，杜运鹏，薛静，杨凤萍，陈绪清，赵春莉，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：