一种用于筛选制造技术

本发明专利技术公开了一种用于筛选

【技术实现步骤摘要】
一种用于筛选SLE铁代谢失衡的外泌体标志物及诊断试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物医学诊断
，具体涉及一种用于筛选
SLE
铁代谢失衡的外泌体标志物及诊断试剂盒
。

技术介绍

[0002]系统性红斑狼疮
(SLE)
是一种典型的自身免疫性疾病，被称为世界三大疑难病症之一，其病程长，易复发，异质性较高，对肾脏
、
皮肤
、
关节
、
心血管和神经系统等多个器官和系统产生重大影响，
SLE
患者需要长期甚至终身服药，生活质量受到严重影响
。
狼疮性肾炎
(LN)
是
SLE
最严重的并发症，约
70
％的
SLE
患者有肾损伤的临床表现，对肾脏活检组织进行免疫荧光和电子显微镜检查时发现
100
％的
SLE
患者肾受累
。SLE
的发生和发展可以由遗传因素
、
环境因素
、
免疫调节
、
激素水平和表观遗传调控等因素引起，但其具体发病机制尚未明晰，加之
SLE
临床症状严重
、
异质性高等难题，使其诊断和治疗均面临巨大挑战
。
[0003]当前诊断
SLE
的标准主要是基于临床表现和传统实验室检测的结合的方式，肾组织活检目前仍是诊断狼疮肾炎的“金标准”，也是决定患者是否需要治疗的关键，但是具有创伤性和危险性，不适合多次重复检测，较难评估疾病进展的动态过程
。
而其他血清学检测指标，如抗
dsDNA
抗体
、
尿蛋白
、C3
和
C4
等，存在敏感性不足和无法评估预后的问题
。
干扰素
(IFN)
已被多项研究确定为
SLE
的关键致病介质，但是其在血液中不稳定，难以有效检测出其真实含量
。
目前尚无一种高敏感性
、
高特异性
、
稳定性好
、
易于检测
、
无创或低创的
SLE
诊断生物标志物和方法，因此，筛选新的诊断标志物及相关诊断试剂盒的开发，对提高
SLE
的诊疗水平具有重要意义
。
[0004]越来越多的证据表明，免疫细胞铁代谢紊乱是
SLE
发病的重要原因，在
SLE
患者中经常观察到铁代谢紊乱，某些
SLE
患者可能由于血清铁水平降低而表现出缺铁性贫血的临床体征
。
另外，在肾组织活检中发现：被诊断为狼疮性肾炎的
SLE
患者的肾组织中出现铁超载的现象，且和肾脏损伤程度密切相关
。
在一项现有的涉及
120
名
SLE
患者的研究中，转铁蛋白和铜蓝蛋白被提议为
LN
的潜在生物标志物
。
铁蛋白水平对并发活动性
LN
的特异性高于抗
dsDNA
抗体或
C3。
提示：铁代谢相关因子有望成为
SLE/LN
的新型诊断标志物，但是这些指标仍缺乏特异性
。
针对该现状，通过筛选
SLE
特异性的铁代谢关键分子有望成为铁代谢紊乱型
SLE
患者个性化诊断方案
。
因此，筛选能够同时预测
SLE
铁代谢失衡和免疫失调的关键生物标志物以及对
SLE
免疫铁代谢紊乱的个性化诊断是亟待解决的难题
。
[0005]外泌体
(exosome)
是真核细胞的内核体产生的胞外囊泡，可由多种细胞分泌，外泌体内容物的成分多种多样，包括核酸
、
蛋白质
、
脂质
、
氨基酸和代谢物等，由于脂质双分子层的保护作用，外泌体及其内容物可以稳定地存在于血液循环和所有体液中而免受降解
。
病理情况下，细胞代谢和功能的变化可以反映在其释放的外泌体中，因此，收集和分离血液
、
尿液
、
唾液或汗液等生物液体中的外泌体，通过对其表面标志物或内容物的检测，可以成为疾病无创诊断的有效手段，而且能通过多次重复检测实时动态监测疾病的进展过程，因此，基于外泌体的诊断生物标志物的开发在
SLE/LN
临床诊断中具有极大的潜在应用价值
。
[0006]我们筛选出了
SLE
中铁代谢相关的差异表达基因，其中
RSAD2
被确认为影响免疫铁代谢的关键基因
。
证明
SLE
患者中
RSAD2
的表达水平较健康对照组明显上调，且与
SLEDAI
‑
2K
评分显著正相关，
RSAD2
和
SLE
的疾病进展以及树突状细胞
(dendritic cells,DCs)
的活化程度密切相关
。
更为重要的是：发现
SLE
患者血浆外泌体高度富集
RSAD2
，将其定义为
RSAD2
high
‑
Exosome
，且
RSAD2
在
SLE
的临床诊断中具有非常高的特异性和敏感性
。
与传统的蛋白类和核酸类生物标志物相比，外泌体递送的蛋白和核酸具有更高的敏感性和稳定性
。
在病理环境中，
RSAD2
表达量明显增多，并被分选至外泌体中，通过低创，甚至无创收集
SLE
患者和健康对照组的外周血和尿液，发现
SLE
患者血液和尿液中外泌体源性
RSAD2(Exosomal
‑
RSAD2)
能更真实
、
稳定地反映
SLE
的疾病状态，检测其中
RSAD2
的含量，能够作为反映免疫铁代谢的重要指标，因此，
Exosomal
‑
RSAD2
有望成为免疫铁代谢紊乱无创诊断的绝佳选择，目前尚无
Exosomal
‑
RSAD
作为
SLE
诊断生物标志物的报道
。
[0007]本专利技术基于前期的研究发现，提出
RSAD2
可以作为
SLE
铁代谢紊乱中的关键生物标志物，构建了外泌体源性
RSAD2
的免疫铁代谢紊乱诊断试剂盒，为
SLE/LN
的无创
、<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种用于筛选
SLE
铁代谢失衡的外泌体标志物，其特征在于：外泌体生物标志物为外泌体来源
RSAD2 mRNA
，对
RSAD2
基因设计引物，所述引物对具体如下：
RSAD2
的引物序列：
FP
：
5'
‑
AACAAGTACATCCCTCGCCG
‑
3'
；
RP
：
5'
‑
AACACAGACTCCACCCGTTG
‑
3'。2.
根据权利要求1所述的一种用于筛选
SLE
铁代谢失衡的外泌体标志物，其特征在于：外泌体为血浆外泌体
。3.
根据权利要求2所述的一种用于筛选
SLE
铁代谢失衡的外泌体标志物，其特征在于：血浆外泌体的制备：采用超高速速离心法分离血浆外泌体，样本血浆在
4℃、2000g、
离心
20min
，收集上清；然后
4℃、10,000g、
离心
30min
，收集上清；
4℃、100,000g、
离心
70min
，收集沉淀；补充适量的
PBS
重悬后，再次
4℃、100,000g、
离心
70min
，沉淀为外泌体；将外泌体重悬于
200
μ
L PBS
缓冲液，经
BCA
蛋白浓度测定试剂盒确定浓度，分装保存于
‑
80℃
备用
。4.
一种用于筛选
SLE
铁代谢失衡的外泌体标志物的诊断试剂盒，其特征在于：包括
EDTA
抗凝管
、
外泌体
RNA
提取试剂
、
反转录反应所需试剂
、
荧光定量
PCR
反应所需试剂
、DEPC
处理水
、
荧光定量
PCR
试剂
、
阳性对照品和阴性对照品；外泌体
RNA
提取试剂包括分离样本外泌体分离所用的试剂和重悬外泌体所用的试剂
。5.
根据权利要求4所述的一种用于筛选
SLE
铁代谢失衡的外泌体标志物的诊断试剂盒，其特征在于：反转录反应所需试剂包括：无
RNA
酶的纯净水
、4
×
的基因组
DNA
去除混合液和5×
反应液
。6.
根据权利要求5所述的一种用于筛选
SLE
铁代谢失衡的外泌体标志物的诊断试剂盒，其特征在于：荧光定量
PCR
反应所需试剂包括
RSAD2
上游引物
、RSAD2
下游引物
、SYBR qPCRMaster Mix
酶以及
ddH2O。7.
根据权利要求3或6所述的一种用于筛选
SLE
铁代谢失衡的外泌体标志物的诊断试剂盒，其特征在于：通过检测外周血
RSAD2 mRNA
的拷贝数实现
SLE
免疫铁代谢紊乱诊断
。8.
根据权利要求7所述的一种用于筛选
SLE
铁代谢失衡的外泌体标志物的诊断试剂盒，其特征在于：外泌体总
RNA
的提取：向分离后的外泌体加入
1mL
的
Trizol
，冰上放置裂解
15min
，加入氯仿
0.2mL
，拧紧盖子，混匀
30s
，冰上静置
10min
，于
4℃
，
12,000g
离心
20min
；取上清约
0.5mL
，转移到
1.5mL
离心管中，加等量异丙醇
0.5mL
混匀，
‑
20℃
过夜，第二天
4℃、12,000g
离心
20min<...

【专利技术属性】
技术研发人员：花春艳，高升，钱恒榕，谢圆圆，陈思燕，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：