一种含有低复杂度结构域蛋白的表达纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种含有低复杂度结构域蛋白的表达纯化方法，包括步骤：一

【技术实现步骤摘要】
一种含有低复杂度结构域蛋白的表达纯化方法


[0001]本专利技术涉及蛋白表达纯化
，具体涉及一种含有低复杂度结构域蛋白的表达纯化方法
。

技术介绍

[0002]表达外源性蛋白的策略，一般是将目的基因与表达载体进行连接，而后将载体转入表达菌株中表达目的蛋白，最后收集细胞并进行破碎
、
富集
、
纯化得到目的蛋白
。
在蛋白表达过程中，鉴于原核表达系统具有繁殖快
、
成本低
、
表达量高等优点，大肠杆菌是表达蛋白最常用的系统
。
蛋白质分离纯化的方法较多，按照其不同的性质，可以分为以下几种
。
按照蛋白溶解度的不同，分为盐析法
、
等电点沉淀法
、
低温有机溶剂沉淀法等；按照蛋白带电性质的不同，分为离子交换层析法
、
电泳法等；按照蛋白分子量大小的不同，分为超滤法
、
透析法
、
尺寸排阻色谱法；利用蛋白对配体的特异性，可使用亲和层析法分离纯化蛋白质，例如：镍柱亲和层析等
。
但没有一种固定的方法能够分离纯化任意一种蛋白质，常常需要联合使用不同的纯化方法进行分离纯化
。
[0003]真核细胞中大多数基因编码的蛋白质可以折叠成稳定的
、
形态独特的结构，但仍有
10
％
‑
20
％的蛋白质组，由于具有低复杂度蛋白质结构域，不能采用稳定的三维结构
。
蛋白的低复杂度结构域
(low complexity domain,LCD)
，又称为固有无序区
(Intrinsically disordered region,IDR)
，通常富含极性
、
芳香族和
/
或带电氨基酸等特定的氨基酸残基，同时具有高度的构象灵活性，提供分子间
/
分子内多价的弱相互作用
。
[0004]具有低复杂度结构域的蛋白在纯化过程中容易聚集，常规蛋白纯化方法难以得到高质量的目的蛋白
。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是针对上述问题，提供一种针对含有低复杂度结构域蛋白的表达纯化方法
。
[0006]本专利技术为了实现其目的，采用的技术方案是：
[0007]一种含有低复杂度结构域蛋白的表达纯化方法，包括如下步骤：
[0008]一
、
构建融合蛋白的表达载体
[0009]构建含融合蛋白编码序列的表达载体，目的蛋白的
N
‑
端依次连接6×
His
标签
、MBP
标签
、
标签切除蛋白酶识别序列
、
接头序列，所述目的蛋白为具有低复杂度结构域的蛋白；
[0010]二
、
将含有融合蛋白编码序列的载体转入大肠杆菌诱导表达“6
×
His
‑
MBP
‑
标签切除蛋白酶识别序列
‑
接头
‑
目的蛋白”融合蛋白，诱导表达后收集细胞；
[0011]三
、
重悬及破碎细胞：将步骤二得到的细胞使用细胞悬浮缓冲液重悬后，先使用低温超高压连续破碎细胞，然后使用超声波细胞粉碎机超声处理，离心分离沉淀和上清液；
[0012]四
、
蛋白纯化
[0013]将步骤三得到的上清液进行蛋白质层析纯化，包括如下步骤：
[0014](1)MBP
柱亲和层析
[0015]将上清液上样至蛋白纯化系统，系统连接
MBP
柱，先于
MBP
柱结合缓冲液中进行结合，而后于
MBP
柱洗脱缓冲液中进行一步洗脱，收集
MBP
柱洗脱峰样品并浓缩；
[0016](2)
肝素柱亲和层析
[0017]蛋白纯化系统连接肝素柱，向上一步完成后得到的浓缩样品溶液加入肝素柱置换缓冲液稀释以降低盐浓度，然后进行肝素柱亲和层析：先于肝素柱结合缓冲液中进行结合，而后于肝素柱洗脱缓冲液中进行梯度洗脱，收集肝素柱洗脱峰样品并浓缩；
[0018](3)
尺寸排阻色谱纯化
[0019]将上一步得到的浓缩样品离心后取上清液进行尺寸排阻色谱；蛋白纯化系统连接尺寸排阻色谱柱，将上清液于储存缓冲液中进行纯化分离，收集洗脱峰样品，即可得到融合蛋白
。
[0020](4)
融合蛋白切割标签后，尺寸排阻色谱纯化
[0021]向上一步得到的样品中加入标签切除蛋白酶切割
His
‑
MBP
标签，切割后浓缩并离心处理样品；蛋白纯化系统连接尺寸排阻色谱柱，将浓缩样品于储存缓冲液中再次进行纯化分离，根据
SDS
‑
PAGE
电泳条带收集对应收集管洗脱峰样品，浓缩后即可得到目的蛋白
。
[0022]所述接头的氨基酸序列为：
SMDIEFVDLEGS。
[0023]所述标签切除蛋白酶识别序列为
SARS
主蛋白酶识别序列，其氨基酸序列为
TTVKLQAGF
；步骤四中所述标签切除蛋白酶为
SARS
主蛋白酶
Mpro
；
[0024]或者，所述标签切除蛋白酶识别序列为烟草蚀纹病毒蛋白酶识别序列，步骤四中所述标签切除蛋白酶为
TEV
蛋白酶
。
可以采用现有技术中常用的标签切除蛋白酶及其对应的识别序列
。
[0025]融合蛋白“6
×
His
‑
MBP
‑
标签切除蛋白酶识别序列
‑
接头”的氨基酸序列如
SEQ ID NO.4
所示
。
[0026]优选地，所述目的蛋白为
ALYREF
蛋白，融合蛋白“6
×
His
‑
MBP
‑
标签切除蛋白酶识别序列
‑
接头
‑
目的蛋白”氨基酸序列如
SEQ ID NO.5
所示
。
[0027]优选地，所述步骤三中，细胞使用细胞悬液重悬后，首先使用低温超高压连续流细胞破碎机破碎细胞悬液5个循环，工作条件是
4℃
，
1500bar
；然后再使用超声波细胞粉碎机超声处理5个循环，工作条件是
120W
，
10min
，开启
15
秒，关闭
30
秒
。
[0028]所述
MBP
柱为
MB本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种含有低复杂度结构域蛋白的表达纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：一
、
构建融合蛋白的表达载体构建含融合蛋白编码序列的表达载体，目的蛋白的
N
‑
端依次连接6×
His
标签
、MBP
标签
、
标签切除蛋白酶识别序列
、
接头序列，所述目的蛋白为具有低复杂度结构域的蛋白；二
、
将含有融合蛋白编码序列的载体转入大肠杆菌诱导表达“6
×
His
‑
MBP
‑
标签切除蛋白酶识别序列
‑
接头
‑
目的蛋白”融合蛋白，诱导表达后收集细胞；三
、
重悬及破碎细胞：将步骤二得到的细胞使用细胞悬浮缓冲液重悬，先使用低温超高压连续破碎细胞，然后使用超声波细胞粉碎机超声处理，离心分离沉淀和上清液；四
、
蛋白纯化将步骤三得到的上清液进行蛋白质层析纯化，包括如下步骤：
(1)MBP
柱亲和层析：将上清液上样至蛋白纯化系统，系统连接
MBP
柱，先于
MBP
柱结合缓冲液中进行结合，而后于
MBP
柱洗脱缓冲液中进行一步洗脱，收集
MBP
柱洗脱峰样品并浓缩；
(2)
肝素柱亲和层析：蛋白纯化系统连接肝素柱，向上一步完成后得到的浓缩样品溶液加入肝素柱置换缓冲液稀释以降低盐浓度，然后进行肝素柱亲和层析：先于肝素柱结合缓冲液中进行结合，而后于肝素柱洗脱缓冲液中进行梯度洗脱，收集肝素柱洗脱峰样品并浓缩；
(5)
尺寸排阻色谱纯化将上一步得到的浓缩样品离心后取上清液进行尺寸排阻色谱；蛋白纯化系统连接尺寸排阻色谱柱，将上清液于储存缓冲液中进行纯化分离，收集洗脱峰样品，即可得到融合蛋白
。(6)
融合蛋白切割标签后尺寸排阻色谱纯化向上一步得到的样品中加入标签切除蛋白酶切割
His
‑
MBP
标签，切割后浓缩并离心处理样品；蛋白纯化系统连接尺寸排阻色谱柱，将浓缩样品于储存缓冲液中再次进行纯化分离，根据
SDS
‑
PAGE
电泳条带收集对应收集管洗脱峰样品，浓缩后即可得到目的蛋白
。2.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述接头的氨基酸序列为：
SMDIEFVDLEGS。3.
根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述标签切除蛋白酶识别序列为
SARS
主蛋白酶识别序列，其氨基酸序列为
TTVKLQAGF
；步骤四中所述标签切除蛋白酶为
SARS
主蛋白酶
Mpro
；或者，所述标签切除蛋白酶识别序列为烟草蚀纹病毒蛋白酶识别序列，步骤四中所述标签切除蛋白酶为
TEV
蛋白酶
。4.
根据权利要求3所述的方法，其特征在于：融合蛋白“6
×
His
‑
MBP
‑
标签切除蛋白酶识别序列
‑
接头”的氨基酸序列如
SEQ ID NO.4
所示
。5.
根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述目的蛋白为
ALYREF
蛋白，融合蛋白“6
×
His
‑
MBP
‑
标签切除蛋白酶识别序列
‑
接头
‑
目的蛋白”氨基酸序列如
SEQ ID NO.5
所示
。6.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤三中，细胞使用细胞悬浮缓冲液重悬后，首先使用低温超高压连续流细胞破碎机破碎细胞悬液5个循环，工作条件是
4℃,1...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗智，王炜，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：