一种用于快速鉴定肺炎克雷伯菌制造技术

本发明专利技术提供一种用于快速鉴定肺炎克雷伯菌

【技术实现步骤摘要】
一种用于快速鉴定肺炎克雷伯菌ST分型的方法


[0001]本专利技术属于光谱分析
，具体涉及运用拉曼光谱方法快速分析不同肺炎克雷伯菌
ST
分型，定性分析光谱特征峰分布，并且比较不同机器学习模型考察肺炎克雷伯菌
ST
分型鉴定方面的准确性
。

技术介绍

[0002]肺炎克雷伯菌
(Kp)
是肠杆菌科家族的一部分，是社区和医院获得性感染的重要因素之一，会导致如呼吸道感染
、
血液感染
、
免疫能力地下和菌血症等
。
由于抗生素的广泛使用，导致肺炎克雷伯菌出现多种耐药基因，呈现多重耐药的趋势
。
因此，运用型别分类手段对该菌进行相关流行病学研究已成为关注焦点
。
肺炎克雷伯菌的传统分型方法有生物分型
、
血清分型
、
噬菌体分型
、
免疫分型
、
药物敏感分型
、
克雷伯菌素分型等，但均存在分型不完全
、
重复性差
、
分辨率低等特点
。
随着分子理论和技术的迅猛发展，基于基因型分型的方法随之产生，如脉冲场凝胶电泳分型
(PFGE)、
核糖体分型
(ribotying)、
多位点序列分型
(MLST)
等
。
但这些技术分析过程繁琐且花费时间较长，这使得快速
、
准确地鉴定不同克雷伯菌分型仍是临床实验室面临的挑战
。
近年来，表面增强拉曼光谱
(SERS)
联合机器学习
(ML)
算法对细菌病原体种属和亚型的鉴别，具有快速
、
准确的特点，得到广泛的研究
。
然而，目前将
SERS
与
ML
相结合来区分菌株分型的研究还较少
。
[0003]现有技术对于微生物分型的鉴定，大多采用简单的统计学分析和定性分型进行数据处理，如申请公布号为
CN109522955A
的专利申请公开的一种微生物分型分析方法，使用凝聚层次聚类对菌株进行聚簇，这样结果往往不够准确，随机性较高
。
随着机器学习
、
人工智能技术的不断发展，基于机器学习
、
智能拉曼光谱数据处理与鉴别方法，将是拉曼光谱仪器处理与鉴别的发展趋势
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是在现有技术的基础上，提供一种用于快速鉴定肺炎克雷伯菌
ST
分型的方法，通过制备表面增强拉曼光谱与机器学习算法相结合的方式，解决检测过程繁琐
、
耗费时间较长等问题
。
[0005]本专利技术的技术方案如下：
[0006]一种用于快速鉴定肺炎克雷伯菌
ST
分型的方法，它包括如下步骤：
[0007](1)
细菌收集：肺炎克雷伯菌菌株的分离和培养；
[0008](2)
细菌鉴定：对步骤
(1)
中获得的菌株，使用基因组测序方式得到核酸序列后，通过多位点序列分析
(MLST)
的方法，根据管家基因对菌株的
ST
分型进行确认；
[0009](3)
样本预处理：向已加热至沸腾的硝酸银溶液中加入柠檬酸钠溶液进行搅拌反应，所得反应液进行离心处理，再将得到的沉淀重悬于去离子水中，得到带有负电的纳米银粒子的拉曼增强基底；
[0010]将步骤
(2)
中鉴定后的每一个
ST
分型，依次与制备好的拉曼增强基底混合，得到不
同
ST
分型菌株的高灵敏度拉曼信号检测基底；
[0011](4)SERS
检测：将步骤
(3)
得到的不同
ST
分型菌株的高灵敏度拉曼信号检测基底进行多次
、
多位点的拉曼光谱采样，分别得到相应的不同
ST
分型菌株样品的拉曼光谱，从而构建不同
ST
分型的肺炎克雷伯菌的拉曼光谱数据库；
[0012](5)
数据质控：将步骤
(4)
中所得不同
ST
分型菌株样品的拉曼光谱依次进行去除尖峰
、
绘制平均拉曼光谱和光谱反卷积处理；
[0013](6)
数据聚类：将步骤
(5)
中质控后的拉曼光谱数据采用正交偏最小二乘判别分析进行聚类分析，通过比较不同
ST
分型菌株之间的差异判断拉曼光谱所属类别，形成不同
ST
分型拉曼向量的分类象限图，通过观察拉曼光谱样本点在分类象限图中的聚类情况来区分不同
ST
分型菌株，使用
R2X、R2Y
和
Q2
这三种指标对聚类分析的结果进行评价；
[0014](7)
数据鉴定：采用不同机器学习算法对步骤
(5)
中质控后的拉曼光谱数据进行自动分析，将不同
ST
分型的肺炎克雷伯菌的光谱数据集，采用均匀随机抽样的方式划分为训练集，验证集和测试集，并训练分类器，使用
K
‑
fold
交叉验证进行检验，所述
K
为1‑
10
的任一整数，通过所训练的分类器对样品数据进行样品类别归属和标注，并存入数据库；
[0015](8)
数据评价：选取部分剩余的样本进行预测能力检验，使用精确度，召回率，
ROC
曲线和混淆矩阵对最终判断模型做修正，对不同机器学习算法的性能进行评估，选出最佳判定模型，具体包括：
[0016][0017][0018][0019]其中：
Precision
代表精确度
、Recall
代表召回率
、AUC
代表
ROC
曲线下面积，其被视为性能指标；
TP、FP、TN
和
FN
分别表示真阳性
、
假阳性
、
真阴性和假阴性的数目，通过这四种情况构成混淆矩阵
。
[0020]对于本专利技术而言，在步骤
(1)
中，肺炎克雷伯菌菌株为临床分离得到的细菌样品
。
在一种优选方案中，细菌收集的过程如下：将肺炎克雷伯菌菌株在
Luria
‑
Bertani(LB)
液体培养基中培养至指数生长期，离心后，得到上清液和菌株颗粒，所得菌株颗粒重悬于去离子水中，菌株的浓度采用平板计数法，在
37℃
培养
24h
的血琼脂平板上进行测定
。
[0021]在本本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种用于快速鉴定肺炎克雷伯菌
ST
分型的方法，其特征在于，它包括如下步骤：
(1)
细菌收集：肺炎克雷伯菌菌株的分离和培养；
(2)
细菌鉴定：对步骤
(1)
中获得的菌株，使用基因组测序方式得到核酸序列后，通过多位点序列分析的方法，根据管家基因对菌株的
ST
分型进行确认；
(3)
样本预处理：向已加热至沸腾的硝酸银溶液中加入柠檬酸钠溶液进行搅拌反应，所得反应液进行离心处理，再将得到的沉淀重悬于去离子水中，得到带有负电的纳米银粒子的拉曼增强基底；将步骤
(2)
中鉴定后的每一个
ST
分型菌株分别接种于磷酸盐缓冲溶液中，依次与制备好的拉曼增强基底混合，得到不同
ST
分型菌株的高灵敏度拉曼信号检测基底；
(4)SERS
检测：将步骤
(3)
得到的不同
ST
分型菌株的高灵敏度拉曼信号检测基底进行多次
、
多位点的拉曼光谱采样，分别得到相应的不同
ST
分型菌株样品的拉曼光谱，从而构建不同
ST
分型的肺炎克雷伯菌的拉曼光谱数据库；
(5)
数据质控：将步骤
(4)
中所得不同
ST
分型菌株样品的拉曼光谱依次进行去除尖峰
、
绘制平均拉曼光谱和光谱反卷积处理；
(6)
数据聚类：将步骤
(5)
中质控后的拉曼光谱数据采用正交偏最小二乘判别分析进行聚类分析，通过比较不同
ST
分型菌株之间的差异判断拉曼光谱所属类别，形成不同
ST
分型拉曼向量的分类象限图，通过观察拉曼光谱样本点在分类象限图中的聚类情况来区分不同
ST
分型菌株，使用
R2X、R2Y
和
Q2
这三种指标对聚类分析的结果进行评价；
(7)
数据鉴定：采用不同机器学习算法对步骤
(5)
中质控后的拉曼光谱数据进行自动分析，将不同
ST
分型的肺炎克雷伯菌的光谱数据集，采用均匀随机抽样的方式划分为训练集，验证集和测试集，并训练分类器，使用
K
‑
fold
交叉验证进行检验，所述
K
为1‑
10
的任一整数，通过所训练的分类器对样品数据进行样品类别归属和标注，并存入数据库；
(8)
数据评价：选取测试集样本进行预测能力检验，使用精确度，召回率，
ROC
曲线和混淆矩阵对最终判断模型做修正，对不同机器学习算法的性能进行评估，选出最佳判定模型，具体包括：具体包括：具体包括：其中：
Precision
代表精确度
、Recall
代表召回率
、AUC
代表
ROC
曲线下面积，其被视为性能指标；
TP、FP、TN
和
FN
分别表示真阳性
、
假阳性
、
真阴性和假阴性的数目，通过这四种情况构成混淆矩阵
。2.
根据权利要求1所述的用于快速鉴定肺炎克雷伯菌
ST
分型的方法，其特征在于，在步骤
(1)
中，所述细菌收集的过程如下：将肺炎克雷伯菌菌株在
Luria
‑
Bertani
液体培养基中培养至指数生长期，离心后，得到上清液和菌株颗粒，所得菌株颗粒重悬于去离子水中，菌株的浓度采用平板计数法，在
37℃
培养
24h
的血琼脂平板上进行测定
。...

【专利技术属性】
技术研发人员：王亮，唐佳伟，张莉滟，田本顺，
申请(专利权)人：广东省人民医院，
类型：发明
国别省市：