一种草莓病毒-寄主物种的多目标基因芯片检测鉴定方法技术

本发明专利技术属于基因芯片技术领域，公开了一种草莓病毒

【技术实现步骤摘要】
一种草莓病毒
‑
寄主物种的多目标基因芯片检测鉴定方法


[0001]本专利技术属于基因芯片
，尤其涉及一种草莓病毒
‑
寄主物种的多目标基因芯片检测鉴定方法
。

技术介绍

[0002]草莓
(Fragaria
×
ananassa Duch.)
，从植物分类上，是蔷薇科草莓属
。
物种的起源主要为亚洲和欧洲，分布较为广泛
。
由于营养价值高，风味口感佳，深受大众喜爱并成为世界种植面积第二的浆果
。
而我国不但是全世界草莓种植面积最大的国家也是草莓的起源地之一
。
[0003]由于草莓是多年生草本植物，为了保证品种遗传稳定性，商业生产的草莓种苗通过如分株或匍匐茎埋压等无性繁殖的方法来产生
。
而且草莓的主要种植制度为连作种植
。
这两个特点就导致草莓病毒病高发且代代相传，使得草莓光合效率降低等问题
。
造成草莓产量
、
甚至品种优良性退化，对草莓生产带来的危害极大
。
据统计，在我国草莓病毒病使草莓减产量最高可达
80
％，最高每年减产
35
万吨，造成经济损失达
30
亿元
。
病毒病在世界各地分布广泛，目前已报道的可侵染草莓的病毒有
20
多种
。
主要对产量造成危害的有草莓皱缩病毒
(Strawberry crinkle vrius
，
SCV or SCrV)、
草莓镶脉病毒
(Strawberry vein banding virus
，
SVBV)、
草莓斑驳病毒
(Strawberry mottle virus
，
SMVorSMoV)、
草莓轻型黄边病毒
(Strawberry mild yellow edge virus
，
SMYEV)
这四种病毒，在种植栽培上主要表现为植株生长量减少，矮化；叶片失绿，畸形；果实结果率降低，品质下降，严重时可导致绝产
。
[0004]目前对草莓常发病毒常用检测方法有酶联免疫吸附测定法
(enzyme
‑
linked immunosorbent assey
，
ELISA)
和
PCR
检测技术
。
酶联免疫吸附测定法本质是一种检测微量物质的固相免疫测定技术，它是在免疫技术的基础上发展的新型免疫测定技术
。
检验原理是将抗原或者抗体固化，酶标，然后与在载体表面的抗原或抗体结合
。
固相上酶量和病毒的量成比例，加入底物后催化显色反应，可根据颜色深浅来定量分析
。
常用的检测方法双抗体夹心酶联免疫吸附法，高效催化效率的酶放大了反应结果，保证了检测的灵敏度
。
目前草莓常见的病毒如
SMoV、SVBV、SMYEaV、SMYEV
等都可以用
ELISA
方法准确灵敏的检测
。
虽然该方法灵敏度高，可大批量检测样品，但是在检测所需的抗血清获得与制备上仍存在技术的限制，过氧化物酶等物质易产生背景误差且易受植物体内杂蛋白干扰使得这种方法在很多的病毒检测上存在短板
。
且
ELISA
检测目标单一，在面对草莓植株多种病毒侵染的状况，检测工作效率低下
。PCR
技术是将微量核酸经过指数级扩增达到检测所需要的量，高效快速这一独特的优点使得
PCR
是目前最广泛检测病毒的方法
。
朱海生等对常见的
SMoV、SVBV、SCV、SMYEV
四种病毒建立了多重
PCR
的检测方法，该方法可以同步检测4种病毒
。
但是
PCR
也存在缺陷，由于其反应原理是利用引物和模板，先合成
cDNA
，然后扩增
。
在操作中引物和模板易污染再经过放大会造成结果假阳性
。
需与其它实验方法相结合相互印证检测结果
。
[0005]草莓种苗在市场上常以组培苗形式流通，这个阶段种苗病毒含量较低难以准确检
测；而且与其他种苗在形态上不易区分，更不要说做品种鉴别
。
出于品种和消费者权益保护的需要，草莓物种鉴定包括品种鉴定日益受到重视
。
草莓品种鉴定的研究中，基于
PCR
技术的分子标记应用广泛，如：随机扩增多态
DNA(RAPD)、
酶切的扩增多态性序列
(CAPS)、
扩增长度片段多态性
(AFLP)
以及限制性长片段长度多态性
(RELP)。
束靖使用
RAPD
技术对蔷薇科作物进行了起源关系以及鉴定的初步研究，
25
对引物，可扩增
250
条稳定的多态性片段；基于表达序列标签开发
SSR
标记，
Meng
等使用
SSR
对野生草莓分析，
10
对引物可扩增多态性序列
189
条
。
[0006]但是以上方法存在实验条件要求高
、
操作复杂
、
重复性差等限制
。
特别是受到已开发标记数量少等问题影响，对一些亲缘关系较近的品种无法区别开来
。
但随着草莓全基因组已经得到阐明，未来这方面或有突破
。
目前对草莓品种鉴定方法的选取，鉴定标记的开发还处于研究与探索阶段
。
[0007]基因芯片技术适用于多目标的检测鉴定，在医疗卫生方面有广泛的应用，徐胜平等开发了检测多种人体发热病原体的基因芯片；周标等对腹泻病毒建立多目标芯片检测体系；而在植物检测方面，陈定虎等针对李痘病毒6个主要株系设计了芯片；贾慧等对两种病毒建立了芯片检测方法
。
因此，亟需设计一种新的草莓病毒
‑
寄主物种的多目标基因芯片检测鉴定方法
。
[0008]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
[0009](1)ELISA
方法在检测所需的抗血清获得与制备上仍存在技术的限制，过氧化物酶等物质易产生背景误差且易受植物体内杂蛋白干扰使得这种方法在很多的病毒检测上存在短板
。
且
ELISA
检测目标单一，在面对草莓植株多种病毒侵染的状况，检测工作效率低下
。
[0010](2)PCR
技术由于其反应原理是利用引物和模板，先合成
cDNA
，然后本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种草莓病毒
‑
寄主物种的多目标基因芯片检测鉴定方法，其特征在于，草莓病毒
‑
寄主物种的多目标基因芯片检测鉴定方法包括：针对草莓轻型黄边病毒
SMYEV、
草莓坏死休克病毒
SNSV、
草莓镶脉病毒
SVBV、
草莓斑驳病毒
SMoV
以及草莓潜隐环斑病毒
SLRSV
的五种病毒，结合寄主草莓物种的属级别进行快速鉴定技术分析；通过特异引物和探针设计，并以聚苯乙烯微孔板作为芯片基片，建立草莓病毒
‑
寄主物种的多目标基因芯片检测鉴定技术
。2.
如权利要求1所述的草莓病毒
‑
寄主物种的多目标基因芯片检测鉴定方法，其特征在于，草莓病毒
‑
寄主物种的多目标基因芯片检测鉴定方法包括以下步骤：步骤一，分别进行
RT
‑
PCR
引物设计
、
反应体系建立以及引物验证；步骤二，分别进行探针的设计
、
芯片杂交判读以及探针的验证；步骤三，进行草莓病毒
‑
寄主物种的多目标基因芯片的验证
。3.
如权利要求2所述的草莓病毒
‑
寄主物种的多目标基因芯片检测鉴定方法，其特征在于，步骤一中的
RT
‑
PCR
引物设计
、
反应体系建立以及引物验证包括：
(1)
在
NCBI
上下载草莓及草莓病毒的
FASTA
格式序列；
(2)
使用
DNA Star
软件
Editseq
功能转化格式，载入
DNAMAN
将同种病毒进行多序列比对选取保守的序列，根据保守序列设计引物；
(3)
根据引物建立
RT
‑
PCR
反应体系，使用
EASYspin RNA
快速提取
KIT
提取苗圃保存的草莓及其病毒样品核酸，验证引物的有效性以及灵敏度
。4.
如权利要求3所述的草莓病毒
‑
寄主物种的多目标基因芯片检测鉴定方法，其特征在于，草莓及草莓病毒特异性引物序列包括：引物
Fragaria
×
ananassa
‑
F
的核苷酸序列为
SEQ ID NO:1
，
54℃
，
20bp
；引物
Fragaria
×
ananassa
‑
R
的核苷酸序列为
SEQ ID NO:2
，
53℃
，
20bp
；目的片段
111bp
；引物
SLRSV
‑
F
的核苷酸序列为
SEQ ID NO:3
，
55℃
，
20bp
；引物
SLRSV
‑
R
的核苷酸序列为
SEQ ID NO:4
，
56℃
，
20bp
；目的片段
327bp
；引物
SNSV
‑
F
的核苷酸序列为
SEQ ID NO:5
，
58℃
，
20bp
；引物
SNSV
‑
R
的核苷酸序列为
SEQ ID NO:6
，
53℃
，
20bp
；目的片段
252bp
；引物
SVBV
‑
F
的核苷酸序列为
SEQ ID NO:7
，
55℃
，
20bp
；引物
SVBV
‑
R
的核苷酸序列为
SEQ ID NO:8
，
54℃
，
20bp
；目的片段
381bp
；引物
SMYEV
‑
F
的核苷酸序列为
SEQ ID NO:9
，
53℃
，
20bp
；引物
SMYEV
‑
R
的核苷酸序列为
SEQ ID NO:10
，
60℃
，
20bp
；目的片段
272bp
；引物
SMoV
‑
F
的核苷酸序列为
SEQ ID NO:11
，
60℃
，
20bp
；引物
SMoV
‑
R
的核苷酸序列为
SEQ ID NO:12
，
53℃
，
20bp
；目的片段
257bp。5.
如权利要求3所述的草莓病毒
‑
寄主物种的多目标基因芯片检测鉴定方...

【专利技术属性】
技术研发人员：许瑾，宋云，尹龙龙，李明福，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：