一种制造技术

本发明专利技术公开了一种

【技术实现步骤摘要】
一种ELISA抗体检测试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于生物检测
，更具体地，本专利技术涉及一种小反刍兽疫病毒
ELISA
抗体检测试剂盒，适用于小反刍动物生物样本中小反刍兽疫病毒抗体的检测
。

技术介绍

[0002]小反刍兽疫
(Peste des petits ruminants
，
PPR)
俗称羊瘟，一种由小反刍兽疫病毒
(Peste des petits ruminants virus
，
PPRV)
引起的急性传染病，是世界动物卫生组织
(WOAH)
规定的法定报告疫病，是
FAO
‑
OIE
逐步控制跨界动物疾病五年行动计划中指出的重点疫病之一
。
[0003]PPRV
属于副黏病毒科麻疹病毒属，有囊膜，结构上与牛瘟病毒
、
犬瘟热病毒
、
麻疹病毒等具有相似性
。PPRV
基因组为单股负链
RNA
，大小为
15948nt
，编码6种结构蛋白，分别为核衣壳蛋白
(N)、
基质蛋白
(M)、
大蛋白
(L)、
磷蛋白
(P)、
血凝素蛋白
(H)、
融合蛋白
(F)
，此外还有两种非结构蛋白
(C
和
V)。
[0004]Hr/>基因全长
1830nt
，编码
609
个氨基酸
。H
蛋白属于病毒外层
II
型糖蛋白，兼具血凝素和神经氨酸酶活性，在病毒吸附入侵过程中发挥重要作用，病毒首先通过
H
蛋白与细胞受体结合，然后在
F
蛋白的协助下进入细胞质
。H
蛋白是宿主免疫系统的主要目的抗原，也是产生中和抗体的重要抗原，广泛应用于亚单位疫苗的研发
。PPRV
对外界环境抵抗力弱，对强酸
、
强碱
、
高温
、
紫外线等十分敏感，可用常规消毒剂杀灭
。
[0005]PPR
易感动物主要包括山羊
、
绵羊
、
羚羊等小反刍动物，也有牛
、
骆驼等动物感染的报告，可与山羊痘病毒和牛瘟病毒等病毒发生双重感染
。
本病主要传染源是患病动物或隐性感染者的分泌物和排泄物，潜伏期一般为3～
10
日，常表现为急性型，患病动物体温迅速升高至
41℃
，高烧持续3～5日，精神沉郁，厌食，口腔黏膜充血溃烂，可发展为坏死性口炎，眼鼻分泌脓性黏液，病畜逐渐消瘦脱水，部分伴有肺炎
、
咳嗽
、
腹式呼吸，严重时发病率可达
100
％，且病死率极高
。
根据临床症状可对
PPR
进行初步诊断，但其症状及病变与其他几种疫病颇为相似，因此需结合实验室诊断加以区分
。
[0006]随着
PPR
全球控制和根除战略的有序进行，未来的疫苗发展趋势应当是各类基因工程疫苗逐步取代目前常用的
PPRV Nigeria75/1
弱毒苗和
PPRV Sungri/96
弱毒苗等活疫苗，从而在确保免疫效果的同时避免病毒扩散，逐步达到根除
PPR
的目的，同时为鉴别诊断提供可行性
。
在该大背景的影响下，开发与新型亚单位疫苗相配套的诊断技术尤为重要，特别是以蛋白
/
多肽为包被抗原，在保证特异性
、
敏感性优异的同时，可在试验过程中全程避免接触活毒
。
综上，研发此类
PPRV
抗体检测试剂盒已是大势所趋，亦是在我国乃至全世界范围根除
PPR
行动中的重要环节
。
[0007]目前，用于
PPR
的抗体检测方法主要有病毒中和试验
(VNT)、
阻断
ELISA、
竞争
ELISA、
间接
ELISA
以及胶体金免疫层析技术
。
病毒中和试验是
WOAH
认定的国际贸易的金标准，具有较高的敏感性及特异性，能够区分
PPR
与牛瘟抗体，但流程复杂，耗时长，不适于大规模检测，且需接触活毒；
ELISA
方法相较于
VNT
更易于在大规模的血清学调查中使用
。
阻断
ELISA
及竞争
ELISA
是基于单克隆抗体建立的抗体检测方法，高度依赖于单克隆抗体的筛选，且可能存在由于病毒变异造成单克隆抗体识别能力下降的风险，而间接
ELISA
方法通常以重组表达蛋白或者多个表位多肽作为检测抗原，不但大大提升了检测的敏感性，且随着抗原制备技术的发展，特异性也得到大大提升，并且间接
ELISA
能有效放大检测信号，大幅提升检测灵敏度，被广泛应用于
PPRV
的抗体检测
。

技术实现思路

[0008]本专利技术提供了一种用于检测小反刍兽疫病毒
H
蛋白抗体的间接
ELISA
试剂盒及其使用方法，该试剂盒以小反刍兽疫病毒血凝素蛋白
(H
蛋白
)
上的抗原表位多肽为包被抗原，能快速检测生物样本中小反刍兽疫病毒抗体，优点在于特异性和敏感性高
、
操作便捷
、
检测成本低
。
[0009]通常情况下，若以单条多肽为包被抗原，一般存在敏感性较低的问题，而较灵敏的多肽在特异性方面难以达到检测要求
。
为解决这一问题，本专利技术通过深入研究筛选出性能优异的小反刍兽疫病毒抗原表位多肽及其组合物，具体的小反刍兽疫病毒抗原表位多肽为序列表中序列1所示多肽
、
序列2所示多肽
、
或序列3所示多肽，所述组合物为序列表中序列1所示多肽
、
序列2所示多肽和序列3所示多肽两种或两种以上任意组合
。
当所述多肽组合物为序列1所示多肽
、
序列2所示多肽
、
序列3所示多肽的其中两种时，两种多肽的质量比为
(0.5
～
1.5)∶(0.5
～
1.5)
，优选的，其质量比为
1∶1
；当所述多肽组合物为序列1所示多肽
、
序列2所示多肽
、
序列3所示多肽的其中三种时，三种多肽的质量比为
(0.5
～
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
小反刍兽疫病毒抗原表位多肽，为序列表中序列1所示多肽
、
序列表中序列2所示多肽或序列表中序列3所示多肽
。2.
小反刍兽疫病毒抗原表位多肽组合物，为序列表中序列1所示多肽
、
序列表中序列2所示多肽和序列表中序列3所示多肽中的两种或者两种以上任意组合
。3.
根据权利要求2所述小反刍兽疫病毒抗原表位多肽组合物，其特征在于：当所述多肽组合为序列1所示多肽
、
序列2所示多肽
、
序列3所示多肽的其中两种组合时，两种多肽的质量比为
(0.5
～
1.5)∶(0.5
～
1.5)
，优选的，其质量比为
1∶1
；当所述多肽组合为序列1所示多肽
、
序列2所示多肽
、
序列3所示多肽的其中三种时，三种多肽的质量比为
(0.5
～
1.5)∶(0.5
～
1.5)∶(0.5
～
1.5)
，优选的，其质量比为
1∶1∶1。4.
一种小反刍兽疫病毒
ELISA
抗体检测试剂盒，包括酶联反应板和酶标二抗；其中所述酶联反应板包被有权利要求1所述的小反刍兽疫病毒抗原表位多肽或者权利要求2或3所述的小反刍兽疫病毒抗原表位多肽组合物
。5.
根据权利要求4所述的小反刍兽疫病毒
ELISA
抗体检测试剂盒，其特征在于：酶联反应板为可拆卸
96
孔酶标板；所述小反刍兽疫病毒抗原表位多肽为化学人工合成肽
。6.
根据权利要求4所述的小反刍兽疫病毒
ELISA
抗体检测试剂盒，其特征在于：所述酶联反应板的制备方法是将小反刍兽疫抗原表位多肽组合物溶于
pH 9.6
的碳酸盐缓冲液中，混合均匀后加入
96
孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔加入浓度为2μ
g/mL
的多肽或多肽组合物
100
μ
L
，置于2～
8℃
环境中8～
12h
，使包被物充分吸附于酶联反应板
。
包被完成后，每孔加入浓度为
5mg/mL
的牛血清白蛋白
(BSA)PBS
缓冲液<...

【专利技术属性】
技术研发人员：张蕾，吕云杨，李静，董春娜，李鹏宇，肖进，
申请(专利权)人：中牧实业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：