表达重组蛋白的制造技术

本发明专利技术提供表达重组蛋白的

【技术实现步骤摘要】
表达重组蛋白的CHO工程细胞株的低代谢高表达方法


[0001]本专利技术涉及表达重组蛋白的
CHO
工程细胞株的低代谢高表达方法
。

技术介绍

[0002]中国仓鼠卵巢细胞（
Chinese hamster ovary, CHO
）因其可以产生与人类来源细胞相似的复杂结构和翻译后修饰蛋白，易于基因操作和工艺放大等优点，已成为生产重组治疗蛋白（
Recombinant treatment protein, RTPs
）和重组抗体药物的理想表达平台
。
目前，近
70%
的已批准的
RTPs
是由
CHO
细胞产生的
。
但由于
CHO
细胞株在表达过程中会出现代谢负荷过重的问题，导致产量降低和代谢物积累，因此寻找一种方法来提高
CHO
细胞株的表达能力具有重要意义
。
近年来，在
CHO
细胞大规模工业化生产过程中，提出了一系列提高
RTPs
表达的措施，以降低生产成本
。
其中，在培养基中添加小分子添加剂可以提高重组蛋白的表达和生产效率，已成为一种有效
、
简单的策略
。
[0003]据研究表明，
CHO
工程细胞株培养过程中添加丁酸盐可提高蛋白产量，但丁酸盐会诱导 CHO 细胞凋亡
、
抑制细胞生长
、
降低细胞活性
。
丙戊酸盐是丁酸盐的类似物，和丁酸盐一样，它也是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂（
Histone deacetylase inhibitors, HDAC
）
。
有研究表明，
VPA
可以改善瞬时转染的
CHO 和
HEK293
细胞中重组蛋白的表达
。
它增加了重组蛋白的
mRNA
的合成
。
在提高蛋白产量方面，丙戊酸钠（
sodium valproate , VPA
）比丁酸钠具有明显优势，但对细胞生长仍有负面影响
。
氨基酸是构成蛋白质的基本单位，是细胞生命活动重要的氮源，细胞悬浮培养过程中，往往通过调节培养基中不同氨基酸含量，来满足细胞生长过程对氨基酸的偏好
。
通过添加含有酪氨酸的二肽如丙氨酰
‑
L
‑
酪氨酸
(Alanoyl
‑
L
‑
tyrosine, Ala
‑
L
‑
tyr)
可以向培养基中补充充足的氨基酸，提高细胞活力和产量，降低乳酸和氨的积累，更好的维持 pH。
维生素是
SFM
培养基的关键成分，对维持细胞生长很重要，并在细胞代谢中发挥调节和控制作用
。
它们可以分为水溶性维生素和脂溶性维生素
。
不同细胞系对维生素的需求差异很大，需要靶向进行优化
。
在
CHO
细胞培养基中添加维生素可以使单克隆抗体的产量增加3倍，但并不是所有的维生素对细胞生长都很重要
。
微量元素是细胞代谢的必需营养素，是
SFM
的主要补充
。
此外，它们参与细胞的酶促反应，这可以调节酶的活性
。
铜（
Cu
），铁（
Fe
），锰（
Mn
），钼，镍（
Ni
），硒（
Se
），硅（
Si
），锌（
Zn
）等是培养基中常用的微量元素
。
其中，
Fe、Se、Cu、Zn
具有显著作用
。
铁是与许多参与
DNA
复制和细胞代谢的酶相关的必需元素
。Fe
缺乏会导致细胞周期在
G0
或
G1
中阻断，或导致快速分裂的细胞进入细胞凋亡
。
柠檬酸铁通常被认为是铁蛋白的替代品，但低浓度的柠檬酸铁有利于
CHO
细胞粘附在微载体上，而高浓度的柠檬酸铁有利于
CHO
细胞在悬浮液中生长
。
也有研究表明硫酸亚铁和柠檬酸钠的联合使用可以提高翻译效率和效价
。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了表达重组蛋白的
CHO
工程细胞株的低代谢高表达方法
。
在本专利技术中，考察了5种小分子添加剂丙戊酸钠
、
丙氨酰
‑
L
‑
酪氨酸
、
抗坏血酸
、
柠檬酸钠
、
硫酸亚铁及其浓度对
CHO
细胞生长的影响及其作为重组蛋白生产增强剂的有效性
。
重点研究了丙戊酸钠作为增加重组蛋白产量的有效化学试剂的可能性，并对哺乳动物细胞周期和重组蛋白表达的影响提供了新的发现
。
所获得的研究结果将有助于未来开发先进
、
有效的重组蛋白生产技术
。
[0005]本专利技术提供表达重组蛋白的
CHO
工程细胞株的低代谢高表达方法，将表达重组蛋白的
CHO
工程细胞株以
1.0
×
106‑
3.0
×
106cells/mL
的初始密度进行培养，并在0‑
24h
内加入终浓度为
1.5
‑
3.0 mmol/ L 的丙戊酸钠
。
[0006]作为优选，所述表达重组蛋白的
CHO
工程细胞株的初始密度为
1.0
×
106cells/mL。
[0007]作为优选，所述
CHO
工程细胞株培养时的培养条件为：
37 ℃
，
5% CO2，摇床培养
。
[0008]作为优选，所述表达重组蛋白的
CHO
工程细胞株为
CHO
‑
rHSA。
[0009]作为优选，将表达重组蛋白的
CHO
工程细胞株进行培养时，立即加入终浓度为
2.0 mmol/ L 的丙戊酸钠
。
[0010]作为优选，将表达重组蛋白的
CHO
工程细胞株进行培养时，还应补充补料培养基
CB5
和葡萄糖
。
[0011]作为优选，所述葡萄糖的浓度为
300 mg/L。
[0012]本专利技术考察了5种小分子添加剂对
CHO<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
表达重组蛋白的
CHO
工程细胞株的低代谢高表达方法，其特征在于：将表达重组蛋白的
CHO
工程细胞株以
1.0
×
106ꢀ‑
3.0
×
10
6 cells/mL
的初始密度进行培养，并在0‑
24h
内加入终浓度为
1.5
‑
3.0 mmol/ L 的丙戊酸钠
。2.
根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述表达重组蛋白的
CHO
工程细胞株的初始密度为
1.0
×
10
6 cells/mL。3.
根据权利要求1所述的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯若飞，李向茸，李洪珊，杨妍梅，谢晶莹，
申请(专利权)人：西北民族大学，
类型：发明
国别省市：