一种卵母细胞单独体外成熟培养体系制造技术

本发明专利技术属于细胞学技术领域，公开了一种卵母细胞单独体外成熟培养体系

【技术实现步骤摘要】
一种卵母细胞单独体外成熟培养体系、构建方法及应用


[0001]本专利技术属于细胞学
，尤其涉及一种卵母细胞单独体外成熟培养体系
、
构建方法及应用
。

技术介绍

[0002]在哺乳动物中，卵泡是雌性生殖的功能基础，它为卵母细胞提供成熟所需的环境
。
在卵泡中，卵母细胞由多层颗粒细胞包裹，起着保护及向卵母细胞提供成熟所需物质的作用，为后续发胚胎育积累营养物质，因此，卵母细胞能否成熟受到卵丘细胞的调控
。
[0003]目前，随着动物胚胎工程技术，如体细胞核移植和体外受精发展，卵母细胞作为动物胚胎体外成熟
(IVM)
技术变得尤为重要
。
卵母细胞作为动物胚胎工程操作技术的重要环节，获得高效成熟的卵母细胞变得尤为重要
。
但是目前，卵母细胞成熟机制尚未有效阐明，卵丘细胞在卵母细胞成熟过程中的作用也没有得到有效揭示，在卵母细胞成熟过程中进行显微注射等操作更难以进行
。
因此，寻找一种立项的卵母细胞体外成熟培养方法对于成熟机理的研本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种卵母细胞单独体外成熟培养体系的构建方法，其特征在于，该构建方法包括：
S1
，对卵母细胞进行去除周围卵丘细胞和添加缝隙连接抑制剂处理，获取卵母细胞成熟差异，并通过钙黄绿素转移法进行免疫荧光染色印证获取的卵母细胞成熟差异；基于上述印证结果明确卵丘卵母细胞复合体间缝隙连接存在的窗口期；
S2
，试通过对比分析卵母细胞成熟过程中核成熟和胞质成熟相关指标及基因表达的情况，分析雌二醇和孕酮在卵母细胞成熟过程中发挥作用的时间点及其对卵母细胞成熟的影响
。2.
根据权利要求1所述的卵母细胞单独体外成熟培养体系的构建方法，其特征在于，在步骤
S1
中，对卵母细胞进行去除周围卵丘细胞处理包括：在不同时间点
0h、12h、19h、25h、31h、33h
去除卵丘细胞，统计卵母细胞成熟率
。3.
根据权利要求1所述的卵母细胞单独体外成熟培养体系的构建方法，其特征在于，在步骤
S1
中，在不同时间点
0h、3h、6h、12h、19h、25h
添加缝隙连接抑制剂，统计成熟率
。4.
根据权利要求1所述的卵母细胞单独体外成熟培养体系的构建方法，其特征在于，在步骤
S1
中，卵丘卵母细胞复合体间缝隙连接存在的窗口期为卵丘细胞在成熟培养
12h
前，通过缝隙连接调控卵母细胞成熟
。5.
根据权利要求1所述的卵母细胞单独体外成熟培养体系的构建方法，其特征在于，在步骤
S2
中，去除卵丘细胞后，在不同时间点
0h、12h、19h、25h
添加浓度为1μ
g/ml
雌二醇和浓度为
100
μ
M
孕酮，统计成熟率
。6.
根据权利要求1所述的卵母细胞单独体外成熟培养体系的构建方法，其特征在于，在步骤
S2
中，雌二醇和孕酮在卵母细胞成熟过程中发挥作用的时间点为
19h
添加
。7.
一种如权利要求1‑6任意一项所述卵母细胞单独体外成熟培养体系的构建方法构建的卵母细胞单独体外成熟培养体系，其特征在于，该体系包括：
DMEM
培养基：
10
％胎牛血清，
100
μ
L/mL
青霉素和
10
μ
g/mL
链霉素添加到
DMEM
培养液中，并经
0.22
μ
m
直径过滤器过滤；成熟培养液：
TCM199
培养基添加
0.91mmol/Lsodium pyruvate、75.00
μ
g/ml
；
Penicillin G
和
50.00
μ
g/mL streptomycin、0.57mmol/L cysteine、0.50
μ
g/mL luteinizing
；
Hormone
，
0.50
μ
g/mL Follicle Stimulating Hormone、10.00ng/mL Epidermal Growth Factor、10.00ng/mL luteinizing hormone
和
10
％卵泡液；操作液：
TCM199
培养基添加
0.91mmol/L sodium pyruvate、75.00
μ
g/mL penicillin G
和

【专利技术属性】
技术研发人员：郇延军，李健，王玲，孙建强，刘刚，相洪晓，毕方龙，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：