一种用于髓过氧化物酶检测的荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种用于髓过氧化物酶检测的荧光探针及其制备方法和应用，本荧光探针可以对活细胞内的

【技术实现步骤摘要】
一种用于髓过氧化物酶检测的荧光探针及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于荧光探针
，具体涉及一种用于髓过氧化物酶检测的荧光探针及其制备方法和应用
。

技术介绍

[0002]髓过氧化物酶（
MPO
），又称过氧化物酶，主要存在于髓系细胞的嗜苯胺蓝颗粒中，是髓系细胞的特异性标志物，可用于临床上鉴别白血病类型
。MPO
与许多疾病的发生机制关系密切，并在吞噬细胞氧化应激过程起重要作用
。
它能够催化细胞内的氯离子和过氧化氢产生次氯酸，从而杀灭细胞吞噬的微生物
。
[0003]目前检测
MPO
的方法主要有以下几种：
1.
连续监测法
:
在酸性条件下
,
以四甲基联苯胺
、
邻甲氧基苯酚或
3,3
′‑
二甲氧基联苯胺为底物
,
测定血液或组织中
MPO
活性
。
方法操作简单，成本较低，但是容易受到其他过氧化物酶或血红素蛋白的干扰，特异性较差
。2.
酶联免疫吸附法（
ELISA
）：利用抗原抗体反应的特异性制备
MPO
特异性抗体
,
通过免疫学方法检测血液中
MPO
含量
。ELISA
检测提高了特异性，但是成本高，需制备高效价抗体，并且检测过程用时长
。3.
流式细胞仪检测：将全血样本处理后
,
最后加入荧光素标记的抗
MPO
抗体或荧光探针
,
利用抗原抗体反应对细胞内的
MPO
染色孵育
,
最后进行流式细胞分析
。
此方法特异性和灵敏度高，并且检测时间短，可以检测细胞内的
MPO。
[0004]临床上辅助判断急性白血病类型，区分急性髓系白血病（主要是粒系或单核细胞）与急性淋巴细胞性白血病的方法是过氧化物酶（
POX
）染色，主要有二氨基联苯胺法（
DAB
）
、
四甲基联苯胺法
、
氧化
WG
‑
KI
法以及传统的
Washburn
法等等
。
其中
ICSH
推荐三种方法：
DAB、
过氧化物酶氨基
‑
甲基卡巴唑染色法及二盐酸联苯胺法
。Washburn
法是根据过氧化物酶能够分解试剂中的过氧化氢，释放出氧气，使无色的联苯胺氧化成蓝色的联苯胺，与亚硝基铁氰化钠结合成棕黑色或棕黄色的颗粒，沉淀于细胞之中，便于临床观察
。DAB
法的原理是过氧化物酶能将无色的
DAB
的氢原子传递给过氧化氢，使前者催化成有色探针沉积在细胞质中
POX
所在部位（呈棕黄色）
。
但是联苯胺（包括
DAB
法）具有毒性和致癌作用，对检验操作人员不友好
。
氧化
WG
‑
KI
法的原理是过氧化物酶分解过氧化物产生新生态氧，后者与
KI(
碘化钾
)
作用产生碘，碘与显色剂中的有效成分结合，形成棕红色或蓝黑色颗粒
。
虽然氧化
WG
‑
KI
法试剂安全，但是难以控制恰当的染色时间，因探针溶于水而容易被冲洗和褪色，容易导致假阴性
。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了克服现有技术存在的缺点和不足，而提供一种用于髓过氧化物酶检测的荧光探针及其制备方法和应用
。
[0006]为实现上述目的，本专利技术的第一个方面是提供一种用于髓过氧化物酶检测的荧光探针，所述荧光探针具有如下结构式：
，
R1、 R2各自独立地选自
H、
苯基
、
取代苯基
、C1‑8的取代或未取代烷基
、C1‑8的取代或未取代烯基，
R3为卤素原子；所述的取代苯基由卤素
、C1‑6烷基
、C1‑6烷氧基
、C1‑6羧基和
C1‑6酯基任意取代；所述的取代烷基和取代烯基由卤素或
C1‑6烷氧基任意取代
。
[0007]优选的，
R1为甲基，
R2为氢，
R3为氟
。
[0008]本专利技术的第二个方面是提供一种用于髓过氧化物酶检测的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：（1）式Ⅰ所示化合物与对氟硝基苯反应在含有碳酸铯的
N,N
‑
二甲基甲酰胺溶液中反应合成得到式Ⅱ所示化合物；（2）式Ⅱ所示化合物与硼氢化钠在反应溶剂中反应，反应溶剂为甲醇
、
二氯甲烷的混合溶剂；（3）将步骤（2）生成化合物与含卤化合物反应，得到式Ⅲ所示化合物；（4）将式Ⅲ所示化合物与氯化亚锡在溶液中反应
。
[0009]式Ⅰ：；式Ⅱ：；式Ⅲ：
。
[0010]优选的，步骤（1）中，式Ⅰ所示化合物与对氟硝基苯的摩尔比为
1:4
‑6，反应体系温度为
80
‑
120℃
，反应时间4‑
6h。
[0011]优选的，步骤（2）中，式Ⅱ所示化合物与硼氢化钠的摩尔比为4‑
5:1
，甲醇和二氯甲烷的体积比为
1:2
‑4，反应温度为
10
‑
40℃
，反应时间为
15
‑
45min。
[0012]优选的，步骤（3）中，
R3为氟，含卤化合物为二乙胺基三氟化硫，步骤（2）生成化合物与二乙胺基三氟化硫按照摩尔比
1:0.8
‑
1.2
反应，反应溶剂为二氯甲烷，反应体系温度为
‑
40
‑
0℃
，反应时间1‑
3h。
[0013]优选的，步骤（4）中，式Ⅲ所示化合物与氯化亚锡的摩尔比为
1:12
‑
18
，所述溶液为甲醇
:
浓盐酸
:
水
=3:1.5
‑
2.5:2.5
‑
3.5
，反应温度为
10
‑
40℃
，反应时间为
10
‑
14h。
[0014]本专利技术的第三个方面是提供如上所述的制备方法制备得到的荧光探针在检测髓过氧化物酶的应用
。
[0015]本专利技术的第四个方面是提供如上制备方法制备得到的荧光探针在检测髓系白血病细胞的应用，所述髓系白血病细胞加入所述荧光探针避光孵本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种用于髓过氧化物酶检测的荧光探针，其特征在于：所述荧光探针具有如下结构式：
R1、R2各自独立地选自
H、
苯基
、
取代苯基
、C1‑8的取代或未取代烷基
、C1‑8的取代或未取代烯基，
R3为卤素原子；所述的取代苯基由卤素
、C1‑6烷基
、C1‑6烷氧基
、C1‑6羧基和
C1‑6酯基任意取代；所述的取代烷基和取代烯基由卤素或
C1‑6烷氧基任意取代
。2.
根据权利要求1所述的用于髓过氧化物酶检测的荧光探针，其特征在于：
R1为甲基，
R2为氢，
R3为氟
。3.
如权利要求1所述的用于髓过氧化物酶检测的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)
式Ⅰ所示化合物与对氟硝基苯反应在含有碳酸铯的
N,N
‑
二甲基甲酰胺溶液中反应合成得到式Ⅱ所示化合物；
(2)
式Ⅱ所示化合物与硼氢化钠在反应溶剂中反应，反应溶剂为甲醇
、
二氯甲烷的混合溶剂；
(3)
将步骤
(2)
生成化合物与含卤化合物反应，得到式Ⅲ所示化合物；
(4)
将式Ⅲ所示化合物与氯化亚锡在溶液中反应；式Ⅰ：式Ⅱ：式Ⅲ：
4.
根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤
(1)
中，式Ⅰ所示化合物与对氟硝基苯的摩尔比为
1:4
‑6，反应体系温度为
80
‑
120℃
，反应时间4‑
6h。5.
根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤
(2)
中，式Ⅱ所示化合物与硼氢化钠的摩尔比为4‑
5...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐峰，张燕珺，郑晓群，项光新，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：