海洋生物被膜细菌的富集培养及其基因组的获取方法技术

本发明专利技术属于海洋微生物检测技术领域，具体涉及海洋生物被膜细菌的富集培养及其基因组的获取方法

【技术实现步骤摘要】
海洋生物被膜细菌的富集培养及其基因组的获取方法


[0001]本专利技术属于海洋微生物检测
，具体涉及海洋生物被膜细菌的富集培养及其基因组的获取方法
。

技术介绍

[0002]目前的细菌培养方法通常适用于具有特定代谢能力的细菌，如氨氧化菌
、
解磷菌等，覆盖面较窄，通用性较差，无法实现广谱地培养复杂群落中的多种细菌
。
产生该技术问题的原因主要有以下三方面：1）富集培养基碳源单一，如仅用葡萄糖作为碳源，无法表征环境中复杂多样的碳源种类；2）未添加或仅添加单一的微量元素，不利于对微量元素需求较高的细菌培养；3）除培养基的营养物质因素，未考虑培养条件因素，如
pH
值波动对微生物生长产生的影响
。
[0003]此外，目前的细菌培养方法未有设计相对应的富集后获取其基因组信息的方法，获取基因组信息不完整
。
原因如下：一方面，目前的细菌培养方法是建立在三代
DNA
测序普及应用之前，直接通过二代
DNA
测序，由于其读长较短无法获得较长的重叠群，从而无法获得完整度高
、
污染度低的高质量基因组（
MAGs
）；另一方面是由于生物信息学技术的限制，现有技术建立时缺乏实现二代
DNA
序列和三代
DNA
序列的混合组装的软件
。

技术实现思路

[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了海洋生物被膜细菌的富集培养及其基因组的获取方法，可高效培养得到结构复杂且稳定的微生物群落，并获得该群落的高质量细菌基因组
。
[0005]本专利技术通过以下技术方案实现：本专利技术所述的海洋生物被膜细菌的富集培养方法，包括以下步骤：（1）采样：采集海洋生物被膜样品
。
[0006]优选的，海洋生物被膜样品优选来自浸没在海水中的岩石表面，人类活动影响较低的海洋区域
。
[0007]（2）样品处理：将采集的样品通过离心去上清液，得到菌体沉淀，将菌体沉淀洗涤后重悬于无菌海水中，再通过过滤得到生物被膜细菌细胞，静置保存
。
[0008]优选的，离心转速为
5000
‑
6000rpm
，时间为5‑
6min
；对菌体沉淀进行洗涤的目的是去除碳源营养，洗涤液为
PBS
；无菌海水是将人工海盐溶于超纯水中灭菌后制得，人工海盐添加量为
30g/L
；过滤采用3μ
m
纤维素酯膜过滤器，可过滤真菌
、
藻类和其他颗粒；静置保存温度为2‑
8℃
，时间为
14
‑
18h
，目的为消耗剩余的碳源营养
。
[0009]（3）配制培养基：培养基包括碳源物质和非碳源物质，非碳源物质的种类和添加量见表1，碳源物质的种类为表2中物质的任意一种，添加量为
1g/L
，分别制备得到表2中
69
种碳源物质相对应的
69
种培养基
。
[0010]优选的，所述培养基的
pH
为
6.5
‑
7.5
；所述培养基还包括
HEPES
，添加量为
1mol/L
，用于稳定微生物群落生长过程中的
pH。
[0011]表
1 所述培养基中非碳源物质
[0012]表
2 所述培养基中碳源物质
[0013]（4）富集培养：将步骤（2）得到的生物被膜细菌细胞分别接种到步骤（3）制备的培
养基中，每种培养基均设有氧培养和无氧培养两种培养条件，黑暗条件下静置培养至生物被膜形成，收集生物被膜菌体并用液氮冷冻，储存用于后续
DNA
提取
。
[0014]优选的，培养温度为
25
‑
26℃
，培养时间
20
‑
30
天，收集生物被膜菌体时的细菌密度
OD
600
为
0.8
‑
1.2
，菌体保存温度
≤
‑
80℃
；有氧培养的气体环境为
80%
的氮气和
20%
的氧气，无氧培养的气体环境为氮气；氮气为高纯度氮气，纯度为
99.999%。
[0015]本专利技术所述的海洋生物被膜细菌基因组的获取方法，通过宏基因组测序和宏基因组分箱技术实现，具体包括以下步骤：
S1、
将收集的生物被膜菌体通过
Illumina
测序技术进行测序，共
138
个样品，每个分别获取
20G
的数据量，并对测序数据通过分箱软件
Maxbin
（
v2.2.6
）获得
MAGs
；
S2、
将步骤
S1
获得的完整度大于
80%、
污染度大于
5%
的
MAGs
用
Metabat
（
v0.32.5
）进行分箱；
S3、
将步骤
S2
获得的完整度大于
80%、
污染度大于
5%
的
MAGs
用
Concoct
（
v1.1.0
）进一步分箱；
S4、
将表2中醇
、
氨基酸
、
有机酸
、
糖四类碳源培养的生物被膜菌体分别混合为4个样本进行
Nanopore
测序，将通过测序获得的长读长序列和步骤
S1、S2、S3
分箱获得的完整度大于
80%、
污染度小于
5%
的
MAGs
进行重组装，即可获得完整度大于
90%、
污染度小于
5%
的高质量非冗余
MAGs。
[0016]步骤
S4
中所述重组装具体包括以下步骤：
S41、
将原始
MAG
构建为索引，使用
Bowtie2
将
Illumina
序列映射到原始
MAG
索引，并使用
Samtools
（
v1.11
）提取匹配的序列；
S42、
针对原始
MAG
对
Nanopore
数据进行
BLASTn
搜索，并且保留具有
99%
以上同一性的匹配序列；
S43、
在单基因组模式中，使用软件
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种海洋生物被膜细菌的富集培养方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）采样：采集海洋生物被膜样品；（2）样品处理：将采集的样品通过离心去上清液，得到菌体沉淀，将菌体沉淀洗涤后重悬于无菌海水中，再通过过滤得到生物被膜细菌细胞，静置保存；（3）配制培养基：培养基包括碳源物质和非碳源物质；所述培养基中非碳源物质的种类和添加量为：
MgSO
4 0.489g/L、NH4Cl 0.25g/L、CaCl
2 0.1g/L、KNO
3 1g/L、KH2PO
4 0.272g/L、Na2HPO
4 0.284g/L、FeCl
3 0.004g/L、H3BO
3 0.0286g/L、MnCl2·
4H2O 0.0181g/L、ZnSO4·
7H2O 0.0222g/L、Na2MoO4·
2H2O 0.00039g/L、CuSO4·
5H2O 0.00079g/L
；所述培养基中碳源物质为醇
、
氨基酸
、
有机酸
、
糖中的任意一种，添加量为
1g/L
，其中，醇为水杨醇
、
卫矛醇
、D
‑
甘露糖醇
、1,3
‑
丙二醇
、
赤藓糖醇
、
胆固醇
、
木糖醇
、
麦芽糖醇
、1,2
‑
己二醇
、L
‑
阿拉伯糖醇
、L
‑
山梨醇
、
乙醇
、
丙三醇
、
戊醇
、
肌醇
、D
‑
阿拉伯糖醇
、D
‑
山梨醇中的任意一种；氨基酸为
L
‑
酪氨酸
、D
‑
酪氨酸
、L
‑
半胱氨酸
、L
‑
丙氨酸
、D
‑
丙氨酸
、L
‑
谷氨酸
、D
‑
谷氨酸
、L
‑
色氨酸
、D
‑
色氨酸
、L
‑
丝氨酸
、D
‑
丝氨酸
、L
‑
亮氨酸
、D
‑
亮氨酸
、D
‑
天冬酰胺
、D
‑
谷氨酰胺
、L
‑
谷氨酰胺
、L
‑
组氨酸
、D
‑
组氨酸
、L
‑
甲硫氨酸
、L
‑
苯丙氨酸
、D
‑
苯丙氨酸
、L
‑
苏氨酸
、
肌氨酸中的任意一种；有机酸为乙酸
、
辛酸
、
富马酸
、D
‑
苹果酸
、
α
‑
酮戊二酸
、
乳酸
、
牛磺酸
、
乙醛酸
、
乙醇酸
、D
‑
葡萄糖酸
、
葡萄糖醛酸
、
丙酮酸
、
草酰乙酸
、
柠檬酸
、
丙烯酸中的任意一种；糖为
L
‑
葡萄糖
、L
‑
岩藻糖
、D
‑
岩藻糖
、D
‑
阿拉伯糖
、L
‑
阿拉伯糖
、L
‑
甘露糖
、D
‑
棉子糖
、D
‑
木糖
、L
‑
半乳糖
、D
‑
果糖
、L
‑
鼠...

【专利技术属性】
技术研发人员：张伟鹏，崔涵，丁维，范燊，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：