改进还原或标记碳水化合物的方法技术

本发明专利技术提供用于改进还原碳水化合物，诸如从糖缀合物释放的聚糖或通过还原胺化来标记碳水化合物过程的方法

【技术实现步骤摘要】
改进还原或标记碳水化合物的方法、装置和试剂盒
[0001]本申请是
2018
年3月
22
日提交的申请号为
201880034596.3
，专利技术名称为“改进还原或标记碳水化合物的方法
、
装置和试剂盒”的专利技术专利申请的分案申请
。
[0002]相关申请的交叉引用
[0003]本申请要求以下申请的权益和优先权：
2017
年3月
23
日提交的美国临时申请
No.62/475,815、2018
年2月
28
日提交的美国临时申请
No.62/636,815
，以及
2018
年3月
17
日提交的美国临时申请
No.62/644,460
，上述文件的全部内容通过引用并入本文而用于所有目的
。


[0004]本专利技术涉及改进通过还原胺化来标记碳水化合物
(
诸如寡糖
)
的效率
、
便利性和速度的领域
。

技术介绍

[0005]在各种商业和法规背景下，必须确定样品中所存在的碳水化合物的性质和含量
。
这对于连接至糖蛋白，且尤其是用作治疗剂的糖蛋白的聚糖的情况尤其如此
。
由于连接至糖蛋白的聚糖会影响糖蛋白功能的关键特性，包括其药代动力学
、
稳定性
、
生物活性和免疫原性，因此确定糖蛋白上存在哪些聚糖非常重要
。
食品和药物管理局
(“FDA”)
要求对连接至生物制剂
(
诸如治疗性糖蛋白和疫苗
)
的碳水化合物进行表征以表明物质组成和制造的相符性，从而需要对产品进行广泛的表征
。
分析碳水化合物的特征
(profile)
对于治疗性和非治疗性重组蛋白质生产中的质量控制也是重要的，其中碳水化合物分布的变化预示系统中的压力
、
信号条件可能需要丢弃商业规模发酵罐中的内容物
。
因此，生物化学家
、
临床化学家
、
药物制造商和蛋白质生产商对确定生物样品
(
诸如治疗性糖蛋白
)
中聚糖的分布特征具有相当大的兴趣
。
[0006]分析碳水化合物，特别是分析通过酶消化从糖蛋白释放的聚糖的一种常用方法是使用适当的染料或标记物利用还原胺化进行标记
。
例如，通过常规去糖基化酶
PNGase F
对从糖蛋白释放的
N
‑
聚糖进行的还原胺化通常通过使聚糖的游离还原端与标记物
(
诸如荧光染料或带电部分
)
的游离氨基缀合来实现
。
用于还原胺化的一种常见标记物是2‑
氨基苯甲酰胺或“2
‑
AB”。
在共有的美国专利
No.5,747,347
中公开了用2‑
AB
进行还原胺化和标记
。
然后，根据所使用的标记物，可以通过多种分析方法，诸如高效液相色谱
(HPLC)、
毛细管电泳
(CE
，包括毛细管区带电泳
、
毛细管凝胶电泳
、
毛细管等电聚焦
、
毛细管等速电泳和胶束电动色谱
)
或微流体分离中的任何一种来分析经标记的聚糖
。N
‑
聚糖的标记和分析进一步记载于例如共有的美国专利
No.8,124,792
和
8,445,292。
国际公开
No.WO2015/166399
公开了衍生有羧基的磁珠在去糖基化和标记过程中的用途
。
[0007]在本领域中仍然需要对标记碳水化合物
(
诸如聚糖
)
的速度和效率进行改进的方法，特别对通过还原胺化来标记碳水化合物
(
诸如聚糖
)
的速度和效率进行改进的方法
。
令人惊讶地，本专利技术满足了这些和其他需求
。

技术实现思路

[0008]本专利技术提供了一种用于改进还原或通过还原胺化来标记碳水化合物的方法
、
装置和试剂盒
。
[0009]在一些实施方案中，本专利技术提供了还原或通过还原胺化标记水性溶液中提供的碳水化合物的体外方法，以及可选地，用于分析经还原或标记的所述碳水化合物的体外方法，该方法包括按以下下列顺序的以下步骤：
(a)
使碳水化合物和水性溶液与有机溶剂混合，以形成有机溶剂与碳水化合物的水性溶液的混合物，其中所述混合物具有约
80
％或以上的有机溶剂与约
20
％或以下水性溶液的比例；
(b)
将碳水化合物的混合物转移至反应容器，所述反应容器具有
(1)
允许试剂引入的第一开口，
(2)
主体，所述主体按以下顺序具有：具有一定区域的横截面的第一区段，设置为遍及所述第一区段的横截面的区域的第一多孔固体载体，具有一定区域的横截面的第二区段，以及在需要排出时允许试剂排出的第二开口；
(c)
在允许碳水化合物保留在第一多孔固体载体上的条件下，使混合物通过第一多孔固体载体，从而使碳水化合物固定在第一多孔固体载体上；
(d)
用有机溶剂或有机溶剂浓度高于
95
％的溶液清洗固定在第一多孔固体载体上的碳水化合物，以除去有机溶剂和水性溶液的混合物以及混合物中没有被保留在第一多孔固体载体上的任何化合物；以及
(e)
还原或者通过还原胺化来标记被固定在第一多孔固体载体上的碳水化合物，从而还原或通过还原胺化来标记所述碳水化合物
。
在一些实施方案中，该方法进一步包括：步骤
e
’
，在还原或标记之后，使用有机溶剂或有机溶剂浓度高于
95
％有机溶剂的溶液来清洗第一多孔固体载体中任何过量的还原剂或标记物
。
在一些实施方案中，该方法进一步包括：步骤
e”，在清洗之后，使用包含至多
20
％有机溶剂的水性溶液来洗脱第一多孔固体载体中经清洗的且经还原或标记的碳水化合物
。
在一些实施方案中，包含至多
20
％有机溶剂的水性溶液包括水或缓冲溶液
。
在一些实施方案中，水性溶液不包含任何有机溶剂
。
在一些实施方案中，第一多孔固体载体由亲水性材料制成或在其表面上具有亲水性材料，其中，所述亲水性材料不带有羧基
。
在一些实施方案中，第一多孔固体载体由亲水性材料制成
。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种用于还原或通过还原胺化来标记水性溶液中提供的碳水化合物的装置，所述装置包括：反应容器，所述反应容器具有主体，所述主体具有
(a)
第一开口，
(b)
具有第一腔室的第一区段，所述第一腔室具有第一横截面，所述第一横截面具有一定区域和第一直径，其中所述第一腔室与所述第一开口流体连接，
(c)
具有第二腔室的第二区段，所述第二腔室具有第二横截面，所述第二横截面具有一定区域和第二直径，其中所述第二腔室与所述第一区段的所述第一腔室流体连接，
(d)
第二开口，所述第二开口与所述第二腔室流体连接，
(e)
第一多孔固体载体，用于捕获所述水性溶液中原本提供的所述碳水化合物，所述第一多孔固体载体设置在所述第一开口和所述第二开口之间，填充所述第一腔室的所述第一横截面的所述区域，并且遍及所述第一横截面的全部区域与所述第一腔室和所述第二腔室流体连接；所述第一多孔固体载体
(1)
由非亲水性材料组成或者具有非亲水性材料的表面，或者
(2)
由亲水性材料组成；以及
(f)
第二多孔固体载体，用于捕获通过还原胺化被标记或还原的所述碳水化合物，所述第二多孔固体载体由亲水性材料组成或具有亲水性材料的表面，其中所述第二多孔固体载体设置在所述第一多孔固体载体和所述第二开口之间并且填充所述第一横截面或所述第二横截面的所述区域
。2.
根据权利要求1所述的装置，其中，所述反应容器的所述主体的所述第一区段的所述直径宽于所述第二区段的所述第二直径
。3.
根据权利要求1所述的装置，其中，所述第一多孔固体载体设置在所述反应容器的所述第一区段中，并且所述第二多孔固体载体设置在所述反应容器的所述第二区段中
。4.
根据权利要求1所述的装置，其中，所述反应容器是管或筒
。5.
根据权利要求1所述的装置，其中，所述反应容器是多孔板中的孔
。6.
根据权利要求5所述的装置，其中，所述孔的所述第二区段是从所述孔的底部突出的尖嘴
。7.
根据权利要求6所述的装置，其中，所述第二多孔固体载体设置在所述尖嘴中
。8.
根据权利要求1所述的装置，其中，所述反应容器在微流体设备内
。9.
根据权利要求1所述的装置，其中，所述第一多孔固体载体由非亲水性材料制成或具有非亲水性材料的表面
。10.
根据权利要求9所述的装置，其中，所述第一多孔固体载体的非亲水性材料具有宽度为
10
微米或更小的孔隙或开口
。11.
根据权利要求9所述的装置，其中，所述非亲水性材料是聚乙烯，并且具有宽度
10
微米或更小的孔隙或开口
。12.
根据权利要求1所述的装置，其中，所述第一多孔固体载体由亲水性材料组成
。13.
根据权利要求
12
所述的装置，其中，所述亲水性材料由以下材料制成：
(a)
玻璃；
(b)
纤维素；
(c)
二氧化硅；
(d)
共价连接有多个氨基丙基
、
二醇
、
氨基甲酰基
、
两性离子基团，或所述基团中的两种或更多种的组合的表面；
(e)
共价连接有多个氨基丙基
、
二醇
、
或氨基甲酰基，或所述基团中的两种或更多种的组合的二氧化硅
。14.
根据权利要求
13
所述的装置，其中，所述第一多孔固体载体由玻璃纤维组成
。15.
根据权利要求1所述的装置，其中，所述第二多孔固体载体的亲水性材料由以下材料制成：
(a)
玻璃；
(b)
纤维素；
(c)
二氧化硅；
(d)
共价连接有多个氨基丙基
、
二醇
、
氨基甲酰基
、
两性离子基团，或所述基团中的两种或更多种的组合的表面；
(e)
共价连接有多个氨基
丙基
、
二醇
、
或氨基甲酰基，或所述基团中的两种或更多种的组合的二氧化硅
。16.
根据权利要求
15
所述的装置，其中，所述第二多孔固体载体的亲水性材料由玻璃纤维组成
。17.
根据权利要求
15
所述的装置，其中，所述二氧化硅为珠或颗粒的形式
。18.
根据权利要求
17
所述的装置，其中，所述珠或颗粒共价连接...

【专利技术属性】
技术研发人员：安德烈斯，
申请(专利权)人：安捷伦科技有限公司，
类型：发明
国别省市：