一种来自枯草芽孢杆菌的脂磷壁酸及其维持牛蛙肠道健康的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种枯草芽孢杆菌脂磷壁酸及其提取方法和应用，枯草芽孢杆菌脂磷壁酸的提取方法包括：准备层析柱，得到装填的层析柱备用；将枯草芽孢杆菌的菌液加入正丁醇，搅拌均匀后离心，取中下层水相，用真空冷冻干燥机冻干得到脂磷壁酸粗提物；将所述脂磷壁酸粗提物溶解于所述平衡缓冲液中，离心处理后取上清液，将所述上清液上样到所述装填的层析柱中，待所述上清液全部进入所述装填的层析柱中，再通过蠕动泵向所述装填的层析柱中加入洗脱液，收集滤液，冻干所述滤液后得到的枯草芽孢杆菌脂磷壁酸

【技术实现步骤摘要】
一种来自枯草芽孢杆菌的脂磷壁酸及其维持牛蛙肠道健康的应用


[0001]本专利技术涉及牛蛙养殖方法，具体涉及一种来自枯草芽孢杆菌的脂磷壁酸及其应用
。

技术介绍

[0002]牛蛙
(Lithobates catesbeianus)
因其生长速度快，肉质鲜美，营养丰富，对环境的适应性强等特点，已成为我国重要的水产养殖品种
。
目前，牛蛙养殖过程中，为了降低饲料中鱼粉的用量，植物蛋白源已成为鱼粉的替代品
。
豆粕因供应稳定
、
价格低廉
、
蛋白含量较高和必需氨基酸相对平衡等优点，现已成为水产动物饲料中替代鱼粉的主要植物蛋白源，但其含有多种抗营养因子，会导致牛蛙肠道菌群失衡，引起牛蛙的豆粕型肠炎，降低其生长性能，从而降低经济效益
。
[0003]益生菌能有效提高养殖动物的肠道健康和对豆粕的利用，后生元
(Postbiotics)
也具有与活菌相似的功能
。
枯草芽孢杆菌
(Bacillus subtilis)
添加到牛蛙饲料中能够提高牛蛙的养殖性能，但膨化饲料加工过程处于的高温和高压条件，这对枯草芽孢杆菌的存活是一个巨大的挑战
。
脂磷壁酸是枯草芽孢杆菌细胞壁的主要成分，其在多个方面发挥重要作用，包括维持细菌结构
、
参与细菌的黏附，促进宿主肠道健康，以及宿主与细菌之间的相互作用等
。
[0004]现有技术中有从乳杆菌中提取脂磷壁酸的方案，例如专利申请
CN115068510A
公开了一种乳杆菌脂磷壁酸的提取方法及其抗炎活性应用，包括以下步骤：
(1)
将乳杆菌通过三氯乙酸法
、TritonX
‑
114
法或正丁醇法进行提取，获得乳杆菌脂磷壁酸粗体物；
(2)
将乳杆菌脂磷壁酸粗体进行疏水层析和阴离子交换层析进行纯化，得到乳杆菌脂磷壁酸产品
。
[0005]乳杆菌脂磷壁酸在细胞层面上，通过调控相关细胞因子的释放来刺激免疫系统发挥其抗炎效果，缺乏活体实验的数据支持
。
由于无法深入了解其在机体中的具体抗炎机制，不能为其在牛蛙养殖中的应用提供支持
。
[0006]也有从丁酸梭菌中提取脂磷壁酸的方案，例如专利申请
CN104161776A
公开了一种来自丁酸梭菌的脂磷壁酸及其调节畜禽免疫应答的用途，先配制成质量百分比为
1.5
‑
2.5
％的
TX
‑
114
溶液备用；然后取8‑
16mL
经
45
‑
50h
培养的丁酸梭菌液离心分层得到菌体湿重；加入
TX
‑
114
溶液离心得到脂磷壁酸的粗提取物；然后在
DEAE
‑
纤维素层析柱上过柱得到脂磷壁酸
。
[0007]丁酸梭菌脂磷壁酸通过调节畜禽动物肠道免疫功能，发挥其抗炎效果
。
然而，牛蛙属两栖类，生活环境和机体代谢与畜禽动物差异很大，且不同的菌株来源功能也不同，难以预料乳杆菌脂磷壁酸
、
丁酸梭菌脂磷壁的功效相同，因此不能为其在牛蛙养殖中的应用提供支持
。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是为了克服牛蛙养殖中投喂高豆粕含量的饲料存在的肠炎频发的问题，提供一种枯草芽孢杆菌脂磷壁酸及其提取方法
。
[0009]脂磷壁酸存在多种生物体中，本专利技术选择枯草芽孢杆菌作为提取原料，这是因为这株枯草芽孢杆菌是牛蛙肠道原籍益生菌
。
目前已被列入
《
饲料添加剂品种目录
(2013)》
中，可作为饲料级微生物添加剂
。
研究发现，枯草芽孢杆菌具有良好的耐受性，可在宿主消化道内定植，产生多种消化酶，消耗肠道氧气维持厌氧环境，抑制病原菌的生长，对宿主生长及免疫，维持肠道菌群稳定都有积极作用
。
[0010]从枯草芽孢杆菌中提取脂磷壁酸，困难之处在于保持它结构的完整性以及提高纯度，本专利技术通过使用正丁醇
‑
凝胶层析法分离脂磷壁酸，能够保持它原有的结构，提高样品的纯度，并且提取得率大于
30
％
。
[0011]具体方案如下：
[0012]一种枯草芽孢杆菌脂磷壁酸的提取方法，包括：
[0013]准备层析柱：将凝胶于水浴锅水浴加热，排除气泡，冷却至室温，得到处理后的凝胶；用平衡缓冲液润洗层析柱，并加到指定刻度，然后将所述处理后的凝胶倒入所述层析柱自由沉降，开启蠕动泵向所述层析柱中加入所述平衡缓冲液，待所述平衡缓冲液在所述凝胶表面持平时停止加入所述平衡缓冲液，得到装填的层析柱备用；所述平衡缓冲液为正丙醇
、
乙酸铵
、
水的混合溶液；
[0014]提取脂磷壁酸：将枯草芽孢杆菌的菌液加入正丁醇，搅拌均匀后离心，取中下层水相，用真空冷冻干燥机冻干得到脂磷壁酸粗提物；
[0015]将所述脂磷壁酸粗提物溶解于所述平衡缓冲液中，离心处理后取上清液，将所述上清液上样到所述装填的层析柱中，待所述上清液全部进入所述装填的层析柱中，再通过蠕动泵向所述装填的层析柱中加入洗脱液，收集滤液，冻干所述滤液后得到的枯草芽孢杆菌脂磷壁酸
。
[0016]进一步的，准备层析柱步骤中，所述凝胶为
CL
‑
4B
凝胶，优选地，将所述
CL
‑
4B
凝胶于水浴锅
55
‑
65℃
水浴
10
‑
30min
排除气泡，冷却至室温，得到处理后的凝胶；
[0017]优选地，所述平衡缓冲液中正丙醇的体积含量为
10
‑
20
％，乙酸铵的浓度为
0.01
‑
0.2M
，所述平衡缓冲液
pH
＝
4.0
‑
5.0
；
[0018]优选地，所述层析柱的尺寸为
(5
‑
15)mm
×
(20
‑
40cm)
，优选为
10mm
×
30cm
的层析柱，用所述平衡缓冲液润洗的所述层析柱，并加到
0.5
‑
2cm
，将所述凝胶倒入所述层析柱自由沉降至终高度为5‑
15cm
，然后用蠕动泵以
0.05
‑
0.15mL/min
流速加所述平衡缓冲液，待所述平衡缓冲液在所述凝胶表面持平时，得到装填的层析柱备用
。
[0019]进一步的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种枯草芽孢杆菌脂磷壁酸的提取方法，其特征在于：包括：准备层析柱：将凝胶于水浴锅水浴加热，排除气泡，冷却至室温，得到处理后的凝胶；用平衡缓冲液润洗层析柱，并加到指定刻度，然后将所述处理后的凝胶倒入所述层析柱自由沉降，开启蠕动泵向所述层析柱中加入所述平衡缓冲液，待所述平衡缓冲液在所述凝胶表面持平时停止加入所述平衡缓冲液，得到装填的层析柱备用；所述平衡缓冲液为正丙醇
、
乙酸铵
、
水的混合溶液；提取脂磷壁酸：将枯草芽孢杆菌的菌液加入正丁醇，搅拌均匀后离心，取中下层水相，用真空冷冻干燥机冻干得到脂磷壁酸粗提物；将所述脂磷壁酸粗提物溶解于所述平衡缓冲液中，离心处理后取上清液，将所述上清液上样到所述装填的层析柱中，待所述上清液全部进入所述装填的层析柱中，再通过蠕动泵向所述装填的层析柱中加入洗脱液，收集滤液，冻干所述滤液后得到的枯草芽孢杆菌脂磷壁酸
。2.
根据权利要求1所述枯草芽孢杆菌脂磷壁酸的提取方法，其特征在于：准备层析柱步骤中，所述凝胶为
CL
‑
4B
凝胶，优选地，将所述
CL
‑
4B
凝胶于水浴锅
55
‑
65℃
水浴
10
‑
30min
排除气泡，冷却至室温，得到处理后的凝胶；优选地，所述平衡缓冲液中正丙醇的体积含量为
10
‑
20
％，乙酸铵的浓度为
0.01
‑
0.2M
，所述平衡缓冲液
pH
＝
4.0
‑
5.0
；优选地，所述层析柱的尺寸为
(5
‑
15)mm
×
(20
‑
40cm)
，优选为
10mm
×
30cm
的层析柱，用所述平衡缓冲液润洗的所述层析柱，并加到
0.5
‑
2cm
，将所述凝胶倒入所述层析柱自由沉降至终高度为5‑
15cm
，然后用蠕动泵以
0.05
‑
0.15mL/min
流速加所述平衡缓冲液，待所述平衡缓冲液在所述凝胶表面持平时，得到装填的层析柱备用
。3.
根据权利要求1所述枯草芽孢杆菌脂磷壁酸的提取方法，其特征在于：提取脂磷壁酸步骤中，所述枯草芽孢杆菌的菌液和正丁醇的体积比为
1:1
‑2；优选地，所述离心的转速为
5000
‑
10000rpm
，时间为
10
‑
30min
；优选地，所述洗脱液为含有体积分数
21
‑
40
％正丙醇的
0.01
‑
0.2M
乙酸铵，
pH
＝4‑
5。4.
根据权利要求1‑3任一项所述枯草芽孢杆菌脂磷壁酸的提取方法，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌脂磷壁酸为淡棕黄色固体，所述枯草芽孢杆菌脂磷壁酸的提取得率为
33.12
±
1.58
％，
n
＝
3。5.
权利要求1‑4任一项所述枯草芽孢杆菌脂磷壁酸的提取方法制备得到的枯草芽孢杆菌脂磷壁酸，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌脂磷壁酸为淡棕黄色固体，红外光谱图中在
3247cm
‑1处有
‑
NH

【专利技术属性】
技术研发人员：张春晓，王玲，鲁康乐，李学山，宋凯，陶炳毅，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：