一种基于制造技术

一种基于

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR
‑
Cas14a1系统快速检测血吸虫核酸的方法及检测血吸虫病的试剂盒


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种基于
CRISPR
‑
Cas14a1
系统的快速核酸检测血吸虫核酸的方法及试剂盒
。

技术介绍

[0002]血吸虫病是由裂体吸虫属血吸虫引起的一种慢性寄生虫病
。
血吸虫病危害严重，不仅影响个人健康，而且对整个血吸虫病流行区域的经济发展也造成影响
。
血吸虫病被世界卫生组织列为
20
种被忽视的热带病之一，是世界上第二大致死性寄生虫病
。
世界卫生组织制定了截止
2025
年可能在全球消灭血吸虫病这一公共卫生问题的目标
。
人们越来越重视通过降低血吸虫病流行率和感染强度，来降低发病率的研究工作
。
尽管进行了大量的相关研究，但目前还没有针对血吸虫病的疫苗可用
。
未经及时诊断和治疗的血吸虫病将会引起肝硬化
、
腹水等症状
。
甚至在疾病晚期发展为肺动脉高压
、
门脉高压等严重的并发症危及患者生命
。
因此对血吸虫病的早期诊断和治疗仍然是非常重要的工作
。
我们需要更准确
、
更灵敏的检测方法来帮助诊断血吸虫病
。
然而目前可用的检测方法并不理想，如常规核酸检测
PCR
需要专门的设备和人员，而且检测时间较长，因此限制了它在实际检测中的使用
。
本专利的目的就是能够开发出更加简便
、
快速的血吸虫病检测方法
。
[0003]近年来报道的源于细菌和古细菌中类似于“获得性免疫系统”的
CRISPR(Clustered
[0004]regularly interspaced short palindromic repeats)
系统，是细菌的一种防御机制
。CRISPR
系统分为1类
(I、III、IV
型
)
和2类
(II、V、VI
型
)。
其中2类
V
‑
F
亚型核酸酶
Cas14a1
，相比于其他典型的Ⅱ类核酸酶，大小只有
400
到
700
个氨基酸残基，是目前报道的最小的
Cas
蛋白，还没有被应用于寄生虫的检测
。
同时
Cas14a1
还具有比
Cas12a
更高的
ssDNA
识别能力，能够高效地
、
特异地靶向目标
ssDNA
序列，其特异性识别的机制是通过
sgRNA
与靶标
ssDNA
形成互补配对，构象被激活，从而释放出非特异性的
ssDNA
反式切割活性
。Cas14a1
也因上述特性，在分子诊断领域展现出巨大的应用潜力
。
与其他检测方法相比，基于
CRISPR
‑
Cas14a1
系统的快速核酸检测方法在具有高特异性
、
高敏感性的同时还具有通过可视化荧光直接观察结果的优点，且不需要依赖大型的仪器设备
。
该方法有望可以解决偏远地区医疗条件差从而不能很好的对人群进行血吸虫感染情况监测的痛点，对打破血吸虫病传播周期和实现可持续消灭血吸虫病的目标有重要意义
。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种基于
CRISPR
‑
Cas14a1
系统快速检测血吸虫核酸的方法及检测弓形虫病的试剂盒
。
[0006]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供的技术方案是：一种基于
CRISPR
‑
Cas14a1
系统快速检测血吸虫病的试剂盒，所述试剂盒包括：
[0007]一组扩增血吸虫保守靶基因的
RAA
引物：
[0008]RAA
上游引物：
[0009]5’‑
CAGAAACACGAAGAGTGAACCGAGCAGA
‑3’
；
[0010]RAA
下游引物：
[0011]5’‑
ATCTCTGAAACGCGCATACAGGATCCAAG
‑3’
；
[0012]一种特异性检测血吸虫保守靶基因的
sgRNA
序列：
[0013]5’‑
TAATACGACTCACTATAGGGCTTCACTGATAAAGTGGAGAACCGCTTCACCAAA AGCTGTCCCTTAGGGGATTAGAACTTGAGTGAAGGTGGGCTGCTTGCATCAGCCTAAT GTCGAGAAGTGCTTTCTTCGGAAAGTAACCCTCGAAACAAATTCATTTgaaaGAATGAAG GAATGCAACACAAGGTGAAGTCAAGCGAA
‑3’
；
[0014]DNA
荧光探针：
[0015]5’‑
FAM
‑
TTTTTTTTTTTT
‑
BHQ1
‑3’
。
[0016]优选的技术方案为：所述试剂盒还包括：
buffer A
缓冲液
、Buffer B
缓冲液
、
蛋白酶冻干粉
(
购买自杭州众测生物科技有限公司
)
和
CRISPR
‑
Cas14a1
系统检测的反应体系
。
[0017]优选的技术方案为：所述试剂盒还包括：
CRISPR
‑
Cas14a1
蛋白
。
[0018]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供的技术方案是：一种非诊断目的的基于
CRISPR
‑
Cas14a1
系统快速检测血吸虫核酸的方法，包括下列步骤：
[0019]步骤1：使用
DNA
提取试剂盒进行待检测样本的核酸提取，得到待检核酸；
[0020]步骤2：将
41.5
μ
L
的
buffer A
缓冲液
、4
μ
L
的
RAA
上游引物和
RAA
下游引物混合物
、
以及2μ
L
的待检核酸加入到装有反应冻干粉的反应管中，再向反应管加入
2.5
μ
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种基于
CRISPR
‑
Cas14a1
系统快速检测血吸虫病的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：一组扩增血吸虫保守靶基因的
RAA
引物：
RAA
上游引物：5’‑ꢀ
CAGAAACACGAAGAGTGAACCGAGCAGA
‑3’
；
RAA
下游引物：5’‑ꢀ
ATCTCTGAAACGCGCATACAGGATCCAAG
ꢀ‑3’
；一种特异性检测血吸虫保守靶基因的
sgRNA
序列：5’‑
TAATACGACTCACTATAGGGCTTCACTGATAAAGTGGAGAACCGCTTCACCAAAAGCTGTCCCTTAGGGGATTAGAACTTGAGTGAAGGTGGGCTGCTTGCATCAGCCTAATGTCGAGAAGTGCTTTCTTCGGAAAGTAACCCTCGAAACAAATTCATTTgaaaGAATGAAGGAATGCAACACAAGGTGAAGTCAAGCGAA
ꢀ‑3’
；
DNA
荧光探针：5’‑
FAM
‑
TTTTTTTTTTTT
‑
BHQ1
‑3’
。2.
根据权利要求1所述的基于
CRISPR
‑
Cas14a1
系统快速检测血吸虫病的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括：
buffer A
缓冲液
、Buffer B
缓冲液
、
蛋白酶冻干粉和
CRISPR
ꢀ‑
Cas14a1
系统检测的反应体系
。3.
根据权利要求1所述的基于
CRISPR
‑
Cas14a1
系统快速检测血吸虫病的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括：
CRISPR
‑
Cas14a1
蛋白
。4.
一种非诊断目的的基于
CRISPR
‑
Cas14a1
系统快速检测血吸虫核酸的方法，其特征在于：包括下列步骤：步骤1：使用
DNA
提取试剂盒进行待检测样本的核酸提取，得到待检核酸；步骤2：将
41.5
μ
L
的 buffer A
缓冲液
、4
μ
L
的
RAA
上游引物和
RAA
下游引物混合物
、
以及2μ
L
的待检核酸加入到装有反应冻干粉的反应管中，再向反应管加入
2.5
μ
L
的
Buffer B
缓冲液；反应管盖上管盖，混匀后进行
RAA
扩增反应，得到
RAA
扩增产物，然后向反应管中加入
5 U 的
T7 核酸外切酶，降解未被修饰的链；
RAA
上游引物：5’‑ꢀ
CAGAAACACGAAGAGTGAACCGAGCAGA
...

【专利技术属性】
技术研发人员：任翠平，李倩，杨树起，王小凤，邢晨，程苗，杜忆南，祝亚亭，
申请(专利权)人：安徽医科大学，
类型：发明
国别省市：