一种基于制造技术

本发明专利技术涉及酶检测技术领域，公开了一种基于

【技术实现步骤摘要】
一种基于DNA发夹结构的DNA连接酶检测探针及应用


[0001]本专利技术涉及酶检测
，具体涉及一种基于
DNA
发夹结构的
DNA
连接酶检测探针及应用
。

技术介绍

[0002]脱氧核糖核酸
(DNA)
连接酶是
DNA
合成过程中一种必不可少的
、
普遍存在的酶，并在原核和真核细胞中进行复制
、
修复和重组
。
该酶在
ATP
存在下催化双链
DNA
中并列的
5'
磷酸端和
3'
羟基端形成磷酸二酯键
。
无论其来源如何，
DNA
连接酶催化反应的连接机制都有一个共同的特点，即关键步骤是形成共价
DNA
连接酶
‑
腺苷酸中间体
。
此外，已知真核生物
、
古细菌和病毒中的
DNA
连接酶依赖于
ATP
，而细菌中的
DNA
连接酶依赖于
NAD。
因此，
NAD
依赖性
DNA
连接酶被认为是新型抗菌药物的靶标，因为它们广泛存在于细菌中，但在哺乳动物细胞中却很少见
。
近年来，
DNA
连接酶也被作为癌症的生物标志物，因为其过表达和缺陷与癌症和神经退行性疾病的发病密切相关
。
此外，<br/>DNA
连接酶已被用作
DNA
体外操作的重要工具，如
DNA
纳米技术
、DNA
计算以及
DNA
传感
。
因此，检测
DNA
连接酶的活性对药物开发
、
医学诊断以及基础生化研究具有重要意义
。
传统的
DNA
连接酶活性检测方法主要依靠聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影，这是一个复杂且不敏感的过程
。
此外，通过使用多种酶和多步骤反应来检测
DNA
连接酶在过去也得到了发展
。
然而，这些方法的一个缺点是，它们的检测结果不能反映实时
DNA
连接反应
。
[0003]另一方面，“超稳定发夹”的概念是
1989
年引入核酸化学研究领域的，通常是指某些具有超高热稳定性和对核酸酶抗性的短
DNA
或
RNA
序列
。
这些
DNA
和
RNA
序列通常包含7到
10
个核苷酸的长度，并显示发夹状结构
。
尽管非常稳定的发夹的序列相对较短，但它们的熔点高于普通
DNA
发夹
。
尽管非常稳定的发夹具有上述独特的性质，但是这些易于形成的结构在过去还没有被用于检测
DNA
修饰酶
。
[0004]因此有必要开发一种基于
DNA
发夹结构的
DNA
连接酶检测探针及应用，提高探针对
DNA
连接酶检测的灵敏度
、
特异性和稳定性，从而实现对
DNA
连接酶活性的实时检测
。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一
。
为此，本专利技术提出一种基于
DNA
发夹结构的
DNA
连接酶检测探针及应用，提高探针对
DNA
连接酶检测的灵敏度
、
特异性和稳定性，从而实现对
DNA
连接酶活性的实时检测
。
[0006]本专利技术第一方面提供一种基于
DNA
发夹结构的
DNA
连接酶检测探针
。
[0007]具体的，所述
DNA
连接酶检测探针包括四条寡核苷酸链；
[0008]所述四条寡核苷酸链包括短单链
Oligo 1、
长单链
Oligo 2、
长单链
Oligo 3、
短单链
Oligo 4
；
[0009]所述短单链
Oligo 1
可与长单链
Oligo 2
互补形成双链结构1；所述长单链
Oligo 3
可与短单链
Oligo 4
互补形成双链结构2；
[0010]所述双链结构1中长单链
Oligo 2
的未互补部分可与双链结构2中长单链
Oligo 3
的未互补部分进行互补形成双链结构
3。
[0011]优选的，所述长单链
Oligo 3
的5’
端被磷酸修饰；所述长单链
Oligo 3
的3’
端连接荧光基团
。
[0012]进一步优选的，所述荧光基团为
Cy3。
[0013]优选的，所述短单链
Oligo 4
的5’
端连接淬灭基团
。
[0014]进一步优选的，所述淬灭基团为
BHQ2。
[0015]优选的，所述双链结构3中短单链
Oligo 1
与长单链
Oligo 3
相隔一个缺口；所述双链结构3中长单链
Oligo 2
与短单链
Oligo 4
相隔一个缺口
。
[0016]优选的，所述短单链
Oligo 1
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示；所述长单链
Oligo2
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示；所述长单链
Oligo 3
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.3
所示；所述短单链
Oligo 4
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.4
所示
。
[0017]本专利技术第二方面提供一种基于
DNA
发夹结构的
DNA
连接酶检测探针的制备方法
。
[0018]具体的，包括以下步骤：
[0019]将短单链
Oligo 1、
长单链
Oligo 2、
长单链
Oligo 3、
短单链
Oligo 4
与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液及氯化钠溶液于
15
‑
30℃
混合，制得混合液；再混合液于
90
‑
98℃
孵育3‑
10min
，冷却后本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种基于
DNA
发夹结构的
DNA
连接酶检测探针，其特征在于，所述
DNA
连接酶检测探针包括四条寡核苷酸链；所述四条寡核苷酸链包括短单链
Oligo 1、
长单链
Oligo 2、
长单链
Oligo 3、
短单链
Oligo 4
；所述短单链
Oligo 1
可与长单链
Oligo 2
互补形成双链结构1；所述长单链
Oligo 3
可与短单链
Oligo 4
互补形成双链结构2；所述双链结构1中长单链
Oligo 2
的未互补部分可与双链结构2中长单链
Oligo 3
的未互补部分进行互补形成双链结构
3。2.
根据权利要求1所述的
DNA
连接酶检测探针，其特征在于，所述长单链
Oligo3
的5’
端被磷酸修饰；所述长单链
Oligo 3
的3’
端连接荧光基团
。3.
根据权利要求1所述的
DNA
连接酶检测探针，其特征在于，所述短单链
Oligo4
的5’
端连接淬灭基团
。4.
根据权利要求1所述的
DNA
连接酶检测探针，其特征在于，所述双链结构3中短单链
Oligo 1
与长单链
Oligo 3
相隔一个缺口；所述双链结构3中长单链
Oligo 2
与短单链
Oligo 4
相隔一个缺口
。5.
根据权利要求1所述的
DNA
连接酶检测探针，其特征在于，所述短单链
Oligo1
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示；所述长单链
Oligo 2
的核苷酸序列如
...

【专利技术属性】
技术研发人员：张昊，武子昂，
申请(专利权)人：大湾区大学筹，
类型：发明
国别省市：