本发明专利技术公开了一种检测重组人白细胞介素－１２蛋白活性的方法。该方法包括如下步骤：１）用不同浓度的重组人白细胞介素－１２蛋白标准品刺激人自然杀伤细胞ＮＫＧ细胞ＣＧＭＣＣ?Ｎｏ．２９０１产生γ干扰素，检测每种浓度的重组人白细胞介素－１２蛋白标准品刺激人自然杀伤细胞ＮＫＧ细胞ＣＧＭＣＣ?Ｎｏ．２９０１产生的γ干扰素的量，得到标准曲线；２）用于１）相同的方法用待测重组人白细胞介素－１２蛋白进行试验，得到所述γ干扰素的量为其最大值的一半时所对应的待测重组人白细胞介素－１２蛋白的浓度值；３）计算得到所述待测重组人白细胞介素－１２蛋白的活性。本发明专利技术方法操作简便、快速、稳定且成本低廉、具有很高的稳定性、重复性、灵敏度及特异性。因此，本发明专利技术方法在ｒｈＩＬ－１２蛋白活性检测领域将有广阔的应用前景，为ｒｈＩＬ－１２蛋白的临床应用、药性检测等提供了良好的基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
人白细胞介素-12 (Human Interleukin 12，hIL-12)是一种异二聚体细胞因子，由 P35和p40两个亚单位通过多对二硫键连接组成。hIL-12又称为NK细胞刺激因子(NKSF)， hIL-12具有强烈的抗肿瘤和抗病毒效益，这种效应是由机体的自然杀伤细胞(Natural killer cells, NK细胞)介导的，hIL-12还在细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、B细胞的发 育分化和成熟活化中起重要作用，被誉为免疫系统行使抗病毒、抗肿瘤的核心调控因子，机 体天然免疫系统的关键蛋白质。这一系列的生物学功能使人们认识到hIL-12有可能在临 床应用中发挥重要作用。目前，重组人白细胞介素-12 (Recombinant Human Interleukin 12,rhIL-12)作为一种药物已经进入抗肿瘤、抗病毒性疾病和过敏性哮喘的临床试验阶段。 rhIL-12的活性直接关系到临床上治疗效果评价及用药剂量等关键问题。目前，用于活性测 定的NK细胞、T细胞主要来源于正常人外周血或新生儿脐血，由于个体差异，实验稳定性、 重复性、灵敏度均难以保证。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种检测重组人白细胞介素-12蛋白的活性的方法。本专利技术所提供的检测重组人白细胞介素-12蛋白的活性的方法，包括如下步骤1)用不同浓度的重组人白细胞介素-12蛋白标准品刺激人自然杀伤细胞NKG细胞 CGMCC No. 2901产生、干扰素，检测每种浓度的重组人白细胞介素-12蛋白标准品刺激人 自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No. 2901产生的、干扰素的量，以产生的、干扰素的量为 纵坐标，以重组人白细胞介素-12蛋白标准品的浓度为横坐标，作曲线图，得到S型标准曲 线图，从所述S型标准曲线图中得到所述Y干扰素的量为其最大值的一半时所对应的重组 人白细胞介素-12蛋白标准品的浓度值，将该浓度值记作ED5(Is ；2)用不同浓度的待测重组人白细胞介素-12蛋白刺激人自然杀伤细胞NKG细胞 CGMCC No. 2901产生、干扰素，检测每种浓度的待测重组人白细胞介素-12蛋白刺激人自 然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No. 2901产生的、干扰素的量，以产生的、干扰素的量为纵 坐标，以待测重组人白细胞介素-12蛋白的浓度为横坐标，作曲线图，得到S型曲线图，从所 述S型曲线图中得到所述Y干扰素的量为其最大值的一半时所对应的待测重组人白细胞 介素-12蛋白的浓度值，将该浓度值记作ED5to ；3)根据公式I，计算得到所述待测重组人白细胞介素-12蛋白的活性，<formula>formula see original document page 4</formula> ( 公式 I)其中，Ps为重组人白细胞介素-12蛋白标准品的活性值，Pr为待测重组人白细胞 介素-12蛋白的活性值；所述步骤1)中所用的人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No. 2901与所述步骤2)中 所用的人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No. 2901的状态相同，所述步骤1)的刺激NKG细胞 产生Y干扰素的方法与所述步骤2)中的刺激NKG细胞产生Y干扰素的方法相同，所述步 骤1)的检测每种浓度的重组人白细胞介素-12蛋白标准品刺激NKG细胞产生的Y干扰素 的量的方法与所述步骤2)中的检测每种浓度的待测重组人白细胞介素-12蛋白刺激NKG 细胞产生的Y干扰素的量的方法相同；所述步骤1)和所述步骤2)没有先后顺序。上述过程中，所述步骤1)中，所述用不同浓度的重组人白细胞介素-12蛋白标准 品刺激人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No. 2901产生、干扰素的方法包括如下步骤将 所述不同浓度的重组人白细胞介素-12蛋白标准品与所述人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No. 2901共培养，得到所述Y干扰素；所述步骤2)中，所述用不同浓度的待测重组人白细胞介素-12蛋白刺激人自然杀 伤细胞NKG细胞CGMCC No. 2901产生、干扰素的方法包括如下步骤将所述不同浓度的待 测重组人白细胞介素-12蛋白与所述人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No. 2901共培养，得 到所述、干扰素。上述过程中，所述步骤1)的共培养中，所述共培养的体系由所述重组人白细胞介 素-12蛋白标准品、所述人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No. 2901和培养基组成；所述步骤2)的共培养中，所述共培养的体系由所述待测重组人白细胞介素-12蛋 白、所述人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No. 2901和培养基组成；上述过程中，在所述步骤1)和所述步骤2)前，包括如下细胞活化步骤将人自然 杀伤细胞NKG细胞CGMCC No. 2901接种于细胞培养基I中，在温度为37°C、二氧化碳体积浓 度为5%的条件下培养至对数生长期，取对数生长期的细胞；所述细胞培养基I由a-MEM培养基、胎牛血清、马血清和重组人白细胞介素-2组 成，a -MEM培养基、胎牛血清、马血清和重组人白介素-2的配比为8ml a -MEM培养基1ml 胎牛血清1ml马血清1000IU重组人白介素_2。上述过程中，所述共培养中培养基由1640培养基和胎牛血清组成，1640培养基与 胎牛血清的体积比为9 1 ；所述人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No. 2901在所述共培养体系中的浓度为 2. 5X105 个/ml ；所述共培养的温度为37°C，所述共培养的二氧化碳体积浓度为5%，所述共培养 的时间为12-48小时，具体为18-24小时。上述过程中，所述步骤1)中重组人白细胞介素-12蛋白标准品在所述共培养体系 中的浓度分别为 6. 4ng/ml、3. 2ng/ml、l. 6ng/ml、0. 8ng/ml、0. 4ng/ml、0. 2ng/ml、0. lng/ml、 0.05ng/ml ；所述步骤2)中待测重组人白细胞介素-12蛋白在所述共培养体系中的浓度分别 为 6. 4ng/ml、3. 2ng/ml、L 6ng/ml、0. 8ng/ml、0. 4ng/ml、0. 2ng/ml、0. Ing/mKO. 05ng/mlo上述过程中，所述检测Y干扰素的量的方法为酶联免疫法，其中所用的一抗为、 干扰素单克隆抗体。上述过程中，所述重组人白细胞介素-12蛋白的活性为重组人白细胞介素-12蛋白刺激淋巴细胞细胞产生、干扰素的活性；所述淋巴细胞细胞为自然杀伤细胞、T细胞或 B细胞。人自然杀伤细胞NKG细胞CGMCC No. 2901在检测重组人白细胞介素-12蛋白刺激 自然杀伤细胞产生Y干扰素的活性中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术采用人自然杀伤细胞(NKG细胞)CGMCC No. 2901作为测活细胞株，该细胞 株具有性能稳定均一、易培养、传代次数不受限制的特点，并且在IL-12蛋白的刺激下可产 生、干扰素，存在时间-剂量-效应关系，是测rhIL-12蛋白活性得理想载体细胞。实验 证明，本专利技术方法结果准确可靠且重复性好(检测了 3份样品，每个样品进行3次实验，均 得到正确结果)，避免了现有技术中来源于正常人外周血或新生儿脐血的NK细胞、T细胞不 稳定、有时本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测重组人白细胞介素－１２蛋白的活性的方法，包括如下步骤： １）用不同浓度的重组人白细胞介素－１２蛋白标准品刺激人自然杀伤细胞ＮＫＧ细胞ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２９０１产生γ干扰素，检测每种浓度的重组人白细胞介素－１２蛋白标准品刺激人自然杀伤细胞ＮＫＧ细胞ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２９０１产生的γ干扰素的量，以产生的γ干扰素的量为纵坐标，以重组人白细胞介素－１２蛋白标准品的浓度为横坐标，作曲线图，得到Ｓ型标准曲线图，从所述Ｓ型标准曲线图中得到所述γ干扰素的量为其最大值的一半时所对应的重组人白细胞介素－１２蛋白标准品的浓度值，将该浓度值记作ＥＤ↓［５０ｓ］； ２）用不同浓度的待测重组人白细胞介素－１２蛋白刺激人自然杀伤细胞ＮＫＧ细胞ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２９０１产生γ干扰素，检测每种浓度的待测重组人白细胞介素－１２蛋白刺激人自然杀伤细胞ＮＫＧ细胞ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２９０１产生的γ干扰素的量，以产生的γ干扰素的量为纵坐标，以待测重组人白细胞介素－１２蛋白的浓度为横坐标，作曲线图，得到Ｓ型曲线图，从所述Ｓ型曲线图中得到所述γ干扰素的量为其最大值的一半时所对应的待测重组人白细胞介素－１２蛋白的浓度值，将该浓度值记作ＥＤ↓［５０ｒ］； ３）根据公式Ⅰ，计算得到所述待测重组人白细胞介素－１２蛋白的活性， Ｐｒ＝Ｐｓ×ＥＤ↓［５０ｓ］／ＥＤ↓［５０ｒ］（公式Ⅰ） 其中，Ｐｓ为重组人白细胞介素－１２蛋白标准品的活性值，Ｐｒ为待测重组人白细胞介素－１２蛋白的活性值； 所述步骤１）中所用的人自然杀伤细胞ＮＫＧ细胞ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２９０１与所述步骤２）中所用的人自然杀伤细胞ＮＫＧ细胞ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２９０１的状态相同，所述步骤１）的刺激ＮＫＧ细胞产生γ干扰素的方法与所述步骤２）中的刺激ＮＫＧ细胞产生γ干扰素的方法相同，所述步骤１）的检测每种浓度的重组人白细胞介素－１２蛋白标准品刺激ＮＫＧ细胞产生的γ干扰素的量的方法与所述步骤２）中的检测每种浓度的待测重组人白细胞介素－１２蛋白刺激ＮＫＧ细胞产生的γ干扰素的量的方法相同； 所述步骤１）和所述步骤２）没有先后顺序。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：田志刚，程民，魏海明，郑晓东，孙汭，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：34[中国|安徽]
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